Analyse du transport intracytoplasmique de la capside du virus de l’hépatite B : analyse des interactions entre les capsides du VHB et les chaînes du complexe de la dynéine

Hepatitis B virus (HBV) needs the nuclear transcription machinery for replication. The virus thus depends on the transport of its genome from the cell periphery to the nuclear envelope. In general this retrograde intracytoplasmic trafficking is facilitated along Mt (MT) using motor protein complexes of the dynein family. As we showed earlier HBV capsid transport also depends upon intact MT in order to allow their arrival at the nuclear pores, which in turn is required for genome liberation from the capsid.In the analysis we used virus-derived HBV capsids obtained from the supernatant of HepG2.2.15, which contain the mature partially double-stranded DNA genome (mature capsids) and capsids expressed in E. coli. The latter were applied in two forms: as unspecific E. coli RNA- containing capsids and as empty capsids. Upon microinjection into Xenopus laevis oocytes we observed that mature and empty capsids were translocated to the nuclear pores with a similar kinetic. RNA-containing capsids failed to arrive at the pores implying that transport of the two other capsid types was active. Active translocation was confirmed by pre-injecting anti tubulin antibodies which interfere with MT-mediated translocation.In vitro reconstitution assays confirmed the specific attachment of mature and empty capsids to MTs and showed the need of further cytosolic proteins. Using pull-down and co-sedimentation experiments we identified one dynein light chain (DYNLL1, member of the Lc8 family) as interaction partner of the capsids. Injecting an excess of recombinant DYNLL1 with empty capsids into Xenopus laevis oocytes inhibited capsid transport to the nuclear pores indicating that DYNLL1 was only functional interaction partner implied in active transport.DNYLL2 did not interact with the capsids although differing from DYNLL1 by just six amino acids. Site directed mutagenesis of DYNLL1 revealed that two amino acids were critical for a direct interaction with the capsids. Both localized at the exterior of the DYNLL1 dimer and not in the groove of DYNLL1, which interacts with the dynein intermediate chain. Accordingly we could reconstitute a complex consisting of empty capsids, DYNLL1 and dynein intermediate chain as it should be in the in vivo situation.Le virus de l’hépatite B (VHB) utilise la machinerie transcriptionnelle nucléaire pour sa réplication. Le génome viral est transporté de la périphérie cellulaire à l’enveloppe nucléaire. Généralement, ce transport intracytoplasmique rétrograde est facilité par le réseau de Mt via l’utilisation du complexe moteur de la dynéine. Nous avons montré que le transport des capsides du VHB dépend des Mt, ce qui permet l’adressage des capsides aux complexes du pore nucléaire (NPC) ; lequel est requis pour l’étape de libération du génome de la capside dans le noyau.Dans cette étude, nous avons utilisé des capsides provenant de virus récupérés dans du surnageant de HepG2.2.15, qui contiennent le génome mature partiellement double brin (capsides matures), et des capsides exprimées chez E.coli. Ces dernières sont utilisées telles quelles, capsides E.coli contenant de l’ARN, ou bien sont utilisées pour préparer des capsides vides. Après microinjection dans des ovocytes de Xenopus laevis, nous avons observé que les capsides vides et les capsides matures sont transloquées aux NPC avec une cinétique similaire. Les capsides contenant de l’ARN ne sont pas identifiées aux NPCs ce qui implique que le transport des deux autres types de capsides est actif. Cela a été confirmé par la pré-injection d’anticorps anti tubuline qui neutralisent le transport assuré par les Mt.L’attachement spécifique des capsides matures et vides aux Mt a été confirmé en utilisant des Mt polymérisés in vitro, nous avons montré que cette interaction nécessitait des protéines cytosoliques. En utilisant des expériences de coïmmunoprécipitation et de cosédimentation nous avons identifié une chaîne légère de la dynéine (DynLL1 membre de la famille Lc8) comme partenaire des capsides. Dans les expériences de microinjection, la comicroinjection d’un excès de DynLL1 avec les capsides inhibe leur transport vers les NPCs, indiquant que DynLL1 est impliquée dans le transport actif des capsides.DynLL2 qui n’interagit pas avec les capsides diffère de DynLL1 de seulement six acides aminés. Par mutagénèse dirigée de DynLL1, nous avons montré l’implication de deux acides aminés dans l’interaction directe avec les capsides. Ces deux acides aminés sont présents à la surface du dimère de DynLL1 et absents dans le sillon résultant de la dimérisation de DynLL1, sillon impliqué dans l’interaction avec la DynIC. Nous avons partiellement reconstitué le complexe DynIC, DynLL1 et capsides vides qui doit en partie refléter la situation in vivo

Expression of viral polymerase and phosphorylation of core protein determine core and capsid localization of the human hepatitis B virus

Biopsies from patients show that hepadnaviral core proteins and capsids-collectively called core-are found in the nucleus and cytoplasm of infected hepatocytes. In the majority of studies, cytoplasmic core localization is related to low viraemia while nuclear core localization is associated with high viral loads. In order to better understand the molecular interactions leading to core localization, we analysed transfected hepatoma cells using immune fluorescence microscopy. We observed that expression of core protein in the absence of other viral proteins led to nuclear localization of core protein and capsids, while expression of core in the context of the other viral proteins resulted in a predominantly cytoplasmic localization. Analysis of which viral partner was responsible for cytoplasmic retention indicated that the HBx, surface proteins and HBeAg had no impact but that the viral polymerase was the major determinant. Further analysis revealed that e, an RNA structure to which the viral polymerase binds, was essential for cytoplasmic retention. Furthermore, we showed that core protein phosphorylation at Ser 164 was essential for the cytoplasmic core localization phenotype, which is likely to explain differences observed between individual cells

Analysis of interactions between HBV capsids and the chains of the dynein motor complex

Le virus de l’hépatite B (VHB) utilise la machinerie transcriptionnelle nucléaire pour sa réplication. Le génome viral est transporté de la périphérie cellulaire à l’enveloppe nucléaire. Généralement, ce transport intracytoplasmique rétrograde est facilité par le réseau de Mt via l’utilisation du complexe moteur de la dynéine. Nous avons montré que le transport des capsides du VHB dépend des Mt, ce qui permet l’adressage des capsides aux complexes du pore nucléaire (NPC) ; lequel est requis pour l’étape de libération du génome de la capside dans le noyau.Dans cette étude, nous avons utilisé des capsides provenant de virus récupérés dans du surnageant de HepG2.2.15, qui contiennent le génome mature partiellement double brin (capsides matures), et des capsides exprimées chez E.coli. Ces dernières sont utilisées telles quelles, capsides E.coli contenant de l’ARN, ou bien sont utilisées pour préparer des capsides vides. Après microinjection dans des ovocytes de Xenopus laevis, nous avons observé que les capsides vides et les capsides matures sont transloquées aux NPC avec une cinétique similaire. Les capsides contenant de l’ARN ne sont pas identifiées aux NPCs ce qui implique que le transport des deux autres types de capsides est actif. Cela a été confirmé par la pré-injection d’anticorps anti tubuline qui neutralisent le transport assuré par les Mt.L’attachement spécifique des capsides matures et vides aux Mt a été confirmé en utilisant des Mt polymérisés in vitro, nous avons montré que cette interaction nécessitait des protéines cytosoliques. En utilisant des expériences de coïmmunoprécipitation et de cosédimentation nous avons identifié une chaîne légère de la dynéine (DynLL1 membre de la famille Lc8) comme partenaire des capsides. Dans les expériences de microinjection, la comicroinjection d’un excès de DynLL1 avec les capsides inhibe leur transport vers les NPCs, indiquant que DynLL1 est impliquée dans le transport actif des capsides.DynLL2 qui n’interagit pas avec les capsides diffère de DynLL1 de seulement six acides aminés. Par mutagénèse dirigée de DynLL1, nous avons montré l’implication de deux acides aminés dans l’interaction directe avec les capsides. Ces deux acides aminés sont présents à la surface du dimère de DynLL1 et absents dans le sillon résultant de la dimérisation de DynLL1, sillon impliqué dans l’interaction avec la DynIC. Nous avons partiellement reconstitué le complexe DynIC, DynLL1 et capsides vides qui doit en partie refléter la situation in vivo.Hepatitis B virus (HBV) needs the nuclear transcription machinery for replication. The virus thus depends on the transport of its genome from the cell periphery to the nuclear envelope. In general this retrograde intracytoplasmic trafficking is facilitated along Mt (MT) using motor protein complexes of the dynein family. As we showed earlier HBV capsid transport also depends upon intact MT in order to allow their arrival at the nuclear pores, which in turn is required for genome liberation from the capsid.In the analysis we used virus-derived HBV capsids obtained from the supernatant of HepG2.2.15, which contain the mature partially double-stranded DNA genome (mature capsids) and capsids expressed in E. coli. The latter were applied in two forms: as unspecific E. coli RNA- containing capsids and as empty capsids. Upon microinjection into Xenopus laevis oocytes we observed that mature and empty capsids were translocated to the nuclear pores with a similar kinetic. RNA-containing capsids failed to arrive at the pores implying that transport of the two other capsid types was active. Active translocation was confirmed by pre-injecting anti tubulin antibodies which interfere with MT-mediated translocation.In vitro reconstitution assays confirmed the specific attachment of mature and empty capsids to MTs and showed the need of further cytosolic proteins. Using pull-down and co-sedimentation experiments we identified one dynein light chain (DYNLL1, member of the Lc8 family) as interaction partner of the capsids. Injecting an excess of recombinant DYNLL1 with empty capsids into Xenopus laevis oocytes inhibited capsid transport to the nuclear pores indicating that DYNLL1 was only functional interaction partner implied in active transport.DNYLL2 did not interact with the capsids although differing from DYNLL1 by just six amino acids. Site directed mutagenesis of DYNLL1 revealed that two amino acids were critical for a direct interaction with the capsids. Both localized at the exterior of the DYNLL1 dimer and not in the groove of DYNLL1, which interacts with the dynein intermediate chain. Accordingly we could reconstitute a complex consisting of empty capsids, DYNLL1 and dynein intermediate chain as it should be in the in vivo situation

Virus Infection Triggers MAVS Polymers of Distinct Molecular Weight

The mitochondrial antiviral signaling (MAVS) adaptor protein is a central signaling hub required for cells to mount an antiviral response following virus sensing by retinoic acid-inducible gene I (RIG-I)-like receptors. MAVS localizes in the membrane of mitochondria and peroxisomes and in mitochondrial-associated endoplasmic reticulum membranes. Structural and functional studies have revealed that MAVS activity relies on the formation of functional high molecular weight prion-like aggregates. The formation of protein aggregates typically relies on a dynamic transition between oligomerization and aggregation states. The existence of intermediate state(s) of MAVS polymers, other than aggregates, has not yet been documented. Here, we used a combination of non-reducing SDS-PAGE and semi-denaturing detergent agarose gel electrophoresis (SDD-AGE) to resolve whole cell extract preparations to distinguish MAVS polymerization states. While SDD-AGE analysis of whole cell extracts revealed the formation of previously described high molecular weight prion-like aggregates upon constitutively active RIG-I ectopic expression and virus infection, non-reducing SDS-PAGE allowed us to demonstrate the induction of lower molecular weight oligomers. Cleavage of MAVS using the NS3/4A protease revealed that anchoring to intracellular membranes is required for the appropriate polymerization into active high molecular weight aggregates. Altogether, our data suggest that RIG-I-dependent MAVS activation involves the coexistence of MAVS polymers with distinct molecular weights

The chaperone dynein LL1 mediates cytoplasmic transport of empty and mature hepatitis B virus capsids

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