Lyophilization and a preliminary thermodynamic characterization of recombinant SCOMT_His6

Catechol-O-methyltransferase (COMT, EC 2.1.1.6) was first described in 1958. COMT is a monomeric enzyme magnesium dependent that is involved in the inactivation of catechol substrates such as dopamine, epinephrine and norepinephrine. COMT is an important target in protein engineering due to their role in normal brain and their possible role in human neurological disorders such as Parkinson's, schizophrenia, depression and Alzheimer's disease. Actually, the most effective treatment for Parkinson’s disease is a triple prophylaxis consisting of the dopamine replacement with levodopa together with an inhibitor of aromatic amino acid decarboxylase and an inhibitor of COMT. In recent years, several COMT inhibitors have been developed for Parkinson's disease treatment, and there is considerable interest in developing new and more effective inhibitors. To do so, two points should be taken into consideration. Firstly, although large quantities of COMT can nowadays be produced through biotechnological processes, is still difficult to maintain the protein in a stable and active state mainly in a more pure state, like that achieved after a chromatographic step. There is no fast way to get active protein unless all the process since the production or (in case of frozen cells) since the lyses was done. To overcome this limitation, in this work, a lyophilization process applied to a purified immobilized-metal affinity chromatograph (IMAC) COMT fraction was study with the objective to store or transporting this fractions more easily and for longer periods. The second aspect to take into account concerns the inhibitors of COMT produced. With the number of new inhibitors being produced, is important to study their interactions with the protein. The microcalorimetric technics appears as a good means to kinetically characterize these interactions. So, also in this work, is discussed an initially approach to establish an isothermal titration calorimetry (ITC) method to study interactions between the COMT enzyme and the 3,5-dinitrocatechol (3,5-DNC) inhibitor.A proteína catecol-O-metiltransferase (COMT, CE 2.1.1.6) foi descrita pela primeira vez em 1958. A COMT é uma enzima monomérica, dependente de magnésio que está envolvida na inativação de substratos com estrutura catecólica como a dopamina, a epinefrina e a norepinefrina. A COMT é um alvo importante na engenharia de proteínas devido à sua função na atividade normal do cérebro e ao seu possível papel em desordens neurológicas humanas, como a doença de Parkinson, esquizofrenia, depressão e Alzheimer. Atualmente, o tratamento mais eficaz para a doença de Parkinson consiste numa tripla profilaxia que consiste na reposição de dopamina com levodopa, um inibidor da enzima descarboxilase dos aminoácidos aromáticos e um inibidor da COMT. Nos últimos anos têm vindo a ser desenvolvidos vários inibidores desta enzima para o tratamento da doença de Parkinson, e há um grande interesse em desenvolver novos inibidores mais eficazes. Para tal, dois pontos devem ser tidos em consideração. Em primeiro lugar, apesar de atualmente ser possível produzir grandes quantidades de COMT por processos biotecnológicos, ainda é difícil manter a proteína num estado estável e ativo, principalmente num estado mais puro, como aquele em que se encontra após um passo cromatográfico. Não há uma forma rápida de obter a proteína a menos que todo o processo desde a produção ou (no caso de células congeladas) desde a lise seja feito. Para ultrapassar essa limitação, neste trabalho, um processo de liofilização aplicado a uma fração purificada por cromatografia de afinidade com metal imobilizado (IMAC) de COMT foi estudado com o objetivo de armazenar ou transportar estas frações mais facilmente e por períodos de tempo maiores. O segundo aspeto a ter em conta diz respeito aos inibidores produzidos para a COMT. Com o número de novos inibidores a serem produzidos, é importante estudar as suas interações com a proteína. As técnicas de microcalorimetria surgem então como um bom meio para caracterizar cineticamente essas interações. Portanto, também neste trabalho, é discutida uma abordagem inicial para estabelecer um método de calorimetria de titulação isotérmica (ITC) para estudar as interações entre a enzima e o inibidor 3,5-dinitrocatecol (3,5-DNC)

Da eco-inovação à sustentabilidade: o papel da política pública

Purpose: This study aims to set empirical evidence on EI determinants to help trace more effective public policies in the field. Design/methodology/approach: Using the Portuguese CIS 14, with 7083 observations, nine logit models were estimated, evaluating probabilities of EI adoptions in general and on the role of their objectives and different policy approaches. Findings/highlights: Statistical support was found based nine hypotheses estimated. The findings confirm the positive effect of innovation in general, R&D, access to funds and size on the probability to eco-innovate. Otherwise, results shed light to the negative effect of higher technological regimes, open innovation and skill intensity on the same probability. Finally, results indicate a higher impact of non-technological innovations over technological innovations on the probability to EI. Research Limitations/implications: The CIS database is not purposefully made to evaluate EIs, lacking some details on its study. Also, the use of one single wave of CIS only allows for cross sectional data estimations, instead of a panel data. Additionally, it only covers one specific country, which may feel short for some generalizable results. Empirical implications: No single policy will meet all dimensions requiring a policy package, combining the demand and the supply side with both carrots and sticks. Originality/value: In this research, a straightforward methodology of analysis was performed producing valuable policy recommendations. Future analysis similarly performed in other CIS countries will allow international comparisonsMotivação: O presente estudo pretende fornecer evidência empírica nos determinantes da eco-inovação com vista a auxiliar a definição de políticas públicas mais eficazes relativas a esta temática. Design/metodologia/ abordagem: Utilizando o CIS 14 para o caso português, com 7083 observações, foram estimados nove modelos logísticos, avaliando a probabilidade de adotar eco-inovações em geral, com base nos seus objetivos e com diferentes instrumentos de política. Resultados/destaques: Foi encontrada evidência estatística para suportar as nove hipóteses elencadas. Os resultados confirmam o efeito positivo da inovação em geral, do R&D, do acesso a fundos e do tamanho da empresa na probabilidade de eco-inovar. Contrariamente ao esperado, os resultados demonstram o impacto negativo de regimes tecnológicos mais intensivos, da inovação aberta e intensidade de competências nesta mesma probabilidade. Finalmente, os resultados indicam um maior impacto das inovações não tecnológicas relativamente às inovações tecnológicas na probabilidade de eco-inovar. Limitações/implicações: A base de dados do CIS não é concebida com o propósito de avaliar eco-inovações em específico, resultando numa falta de detalhe na sua mensuração. Além disso, o uso de uma ronda do CIS, apenas permite uma estimação de dados longitudinais, em vez de dados em painel. Adicionalmente, os dados apenas se debruçam sobre um país em específico, o que pode afigurar-se escasso para a generalização de resultados. Implicações empíricas: Nenhum instrumento político per se atenderá a todas as dimensões exigidas, é necessário um pacote de políticas, combinando os lados políticos da oferta e procura com instrumentos de incentivo e detracção. Originalidade/valor: Neste estudo, uma metodologia de análise assertiva foi imple,mentada produzindo recomendações políticas a considerar. Estudos futuros, com base no CIS de outros países deverão proceder a análises semelhantes com o intuito de formular comparações internacionais e consolidar o papel da política pública no incentivo a estas práticasMestrado em Economi

Sistemas de duas fases aquosas ambientalmente sustentáveis para a purificação de DNA plasmídico

Dissertação de mestrado em Bioquímica AplicadaOs sistemas de duas fases aquosas (SDFA’s) oferecem um grande potencial para a purificação em grande escala de DNA plasmídico (pDNA) para posterior aplicação em terapias moleculares. Estes sistemas baseiam-se na mistura de dois polímeros ou de um polímero e um sal em água, que acima de concentrações críticas formam duas fases distintas que possibilitam a partição diferencial dos compostos adicionados. Considerando as diversas vantagens, que incluem a facilidade de aumento de escala e o baixo custo, destaca-se a operação em contínuo (em macro e microescala) e a elevada capacidade. Neste trabalho, estudou-se a possibilidade de utilização de sistemas de duas fases aquosas ambientalmente sustentáveis para a purificação de pDNA. Testaram-se sistemas polímero-sal e líquido iónico-sal. Foi caracterizado o sistema PEG-citrato de sódio. E observou-se que as curvas binodais obtidas são semelhantes às de outros sistemas PEG-sal bem previamente descritos. A caracterização do sistema permitiu concluir que o efeito de “salting-out” do citrato é fator determinante para a formação e separação das fases. Os estudos de partição e purificação das moléculas de pDNA, presentes no lisado alcalino, permitiram selecionar os sistemas 23% (p/p) citrato de sódio, 20% (p/p) PEG 400 a pH 6,9 e 16% (p/p) citrato de potássio, 36% (p/p) brometo de 1-butil-3-metilimidazólio para posterior purificação num processo multi-estágio. Nestes sistemas, registou-se a acumulação de moléculas de RNA na fase superior. As moléculas de pDNA apresentaram distribuição na fase inferior rica em sal. Apesar de se ter registado a presença de RNA na fase superior destes sistemas, ainda permaneceram moléculas de acido ribonucleico na fase inferior onde também se distribuem as moléculas de plasmídeo. Assim, procedeu-se ao uso de vários estágios para remover a totalidade das moléculas de RNA e dos contaminantes proteicos. Utilizando este processo de multi-estágio obteve-se plasmídeo com elevado grau de pureza na fase inferior. Estes dois sistemas apresentam assim um grande potencial para futura purificação de pDNA em contínuo.Aqueous two-phase systems (ATPS's) offer a great potential for large scale purification of plasmid DNA (pDNA) for subsequent use in molecular therapies. These systems are based on the mixture in water of two polymers or a polymer and a salt - which above critical concentrations form two phases. This allow the differential partition of compounds between the two phases. These systems presents several advantages that includes easy scale-up, low cost, possibility of continuous operation (at macro and micro scale) and high capacity. In this work it was studied the possibility of using environmental friendly aqueous twophase systems for purifying pDNA. The systems tested were polymer-salt and ionic liquid-salt. The system PEG-sodium citrate was characterized and it was observed that binodal curves obtained were similar to other PEG-salt systems previously described. From the characterization of these systems it was concluded that the effect of "salting -out" of citrate is determinant for the formation and separation of the phases. Partition and purification studies of pDNA molecules, present in the alkaline lysate, allowed the selection of the systems 23% (w/w) sodium citrate, 20% (w/w) PEG 400 at pH 6,9 and 16% (w/w) potassium citrate, 36% (w/w) 1-butyl-3-methylimidazolium bromide for further purification in multi-stage process. In these systems, RNA molecules partitioned to the top phase, while plasmid DNA molecules were distributed in the salt-rich bottom phase. Although it was detected the presence of RNA in the top phase of these systems, some ribonucleic acid molecules remained in the bottom phase. Thus, we proceeded to use several stages to remove all of the RNA molecules and protein contaminants. Using this multi-stage process plasmid was obtained with high purity in the bottom phase. These two systems present though great potential for future purification of pDNA in continuous mode

Numerical and Physical Characterization of a Two­Way Coupling Approach for the Simulation of Fluid Flows under Cryogenic Conditions

The crystallization of water droplets is a ubiquitous phenomenon, which plays a fundamental role in many natural and artificial processes. This phenomenon gained particular interest in the aeronautical industry due to ice accretion on lifting surfaces and engine intakes. Additionally, the aerospace sector also uses this phenomenon for the development of cryogenic rocket engines. This dissertation aimed at studying the cooling of water droplets, at different diameters and air humidity ratios, through the conversion of a pre­existent in­house computational tool for that purpose. In order to predict the behavior of discrete particles, a mathematical model that accounted for the physics behind the cooling phenomenon of liquid water droplets was incorporated into the existing code. To predict the convective effects experienced by the droplets two correlations were used: the Ranz­Marshall classical formulation and an empirical transient formulation that corrects the first one. The results obtained were compared with a numerical study that used a one­way coupling model and experimental data available in the literature. To understand how these results are integrated into a complete freezing process, an analytical study of a full­scale four­stage freezing model was performed and further compared with experimental data. The numerical results showed that for, high humidity content, the interaction between the particle and the surrounding environment becomes predominant and needs to be accounted for. When considering low humidity content, this interaction can be neglected since the oneway coupling resembles the experimental data in a better way. Additionally, it was concluded that the complete mixing model, which does not account for deformations and vibrations of droplets, is an acceptable assumption when considering low or high humidity ratios and that for intermediate humidity content, the mixing model assumption, which accounts for those effects, shows close agreement with experimental data. The analytical model implemented for the full­scale supercooling freezing of water droplets was able to predict the phenomenon.A cristalização de gotas de água é um fenómeno omnipresente que desempenha um papel fundamental em inúmeros processos naturais e artificiais. Este fenómeno ganhou um interesse particular na indústria aeronáutica devido à acumulação de gelo em superfícies sustentadores e na admissão dos motores. Adicionalmente, o setor aeroespacial também utiliza este fenómeno no desenvolvimento de combustíveis criogénicos para motores foguete. O objetivo desta dissertação é estudar o arrefecimento de gotas de água, com diâmetros e razões de humidade do ar distintos, readaptando uma ferramenta computacional pré­existente para esse propósito. Deste modo, e tirando partido de um modelo de acoplamento em duas fases, utilizado para prever o comportamento de partículas discretas, já implementado nessa mesma ferramenta, adicionou­se um modelo matemático que considera a física por detrás do arrefecimento de gotas de água em estado líquido. Para prever os efeitos convectivos, a que as gotas estão sujeitas, foram usadas duas correlações distintas: a formulação clássica de Ranz­Marshall e uma formulação transiente que empiricamente corrige a anterior. Os resultados obtidos foram comparados com um estudo numérico onde um modelo de acoplamento em uma só fase foi implementado e dados experimentais disponíveis na literatura. Adicionalmente, para compreender a forma com que estes resultados são integrados num processo completo de congelamento por superarrefecimento, fez­se um estudo analítico utilizando um modelo de quatro fases e, posteriormente, compararam­se esses resultados com dados experimentais. Os resultados numéricos demonstram que para elevadas razões de humidade a interação entre a partícula e o meio envolvente ganha predominância e necessita de ser contabilizada. Quando consideradas baixas razões de humidade, esta interação pode ser desprezada, tendo em conta que o modelo de acoplamento em uma só fase apresenta maior proximidade com os resultados experimentais. Adicionalmente, foi concluído que o modelo de mistura completa, que não contabiliza as vibrações e deformações na gota, é uma aproximação válida quando considerando razões de humidade baixas ou elevadas e que, para razões de humidade intermédias, o modelo de mistura, que contabiliza essas mesmas perturbações, apresenta maior proximidade com os dados experimentais. O modelo analítico implementado para o superarrefecimento completo de gotas de água foi capaz de prever o fenómeno

Biochemistry of adipose tissue: an endocrine organ

Adipose tissue is no longer considered to be an inert tissue that stores fat. This tissue is capable of expanding to accommodate increased lipids through hypertrophy of existing adipocytes and by initiating differentiation of pre-adipocytes. Adipose tissue metabolism exerts an impact on whole-body metabolism. As an endocrine organ, adipose tissue is responsible for the synthesis and secretion of several hormones. These are active in a range of processes, such as control of nutritional intake (leptin, angiotensin), control of sensitivity to insulin and inflammatory process mediators (tumor necrosis factor α (TNF-α), interleukin-6 (IL-6), resistin, visfatin, adiponectin, among others) and pathways (plasminogen activator inhibitor 1 (PAI-1) and acylation stimulating protein (ASP) for example). This paper reviews some of the biochemical and metabolic aspects of adipose tissue and its relationship to inflammatory disease and insulin resistance

Iron Metabolism: From Health to Disease

Background Iron is vital for almost all living organisms by participating in a wide range of metabolic processes. However, iron concentration in body tissues must be tightly regulated since excessive iron may lead to microbial infections or cause tissue damage. Disorders of iron metabolism are among the most common human diseases and cover several conditions with varied clinical manifestations. Methods An extensive literature review on the basic aspects of iron metabolism was performed, and the most recent findings on this field were highlighted as well. Results New insights on iron metabolism have shed light into its real complexity, and its role in both healthy and pathological states has been recognized. Important discoveries about the iron regulatory machine and imbalances in its regulation have been made, which may lead in a near future to the development of new therapeutic strategies against iron disorders. Besides, the toxicity of free iron and its association with several pathologies has been addressed, although it requires further investigations. Conclusion This review will provide students in the fields of biochemistry and health sciences a brief and clear overview of iron physiology and toxicity, as well as imbalances in the iron homeostasis and associated pathological conditions

Metabolic alterations in pregnant women: gestational diabetes

Gestational diabetes mellitus (GDM) and controversy are old friends. The impact of GDM on maternal and fetal health has been increasingly recognized. Nevertheless, universal consensus on the diagnostic methods and thresholds has long been lacking. Published guidelines from major societies differ significantly from one another, with recommendations ranging from aggressive screening to no routine screening at all. As a result, real-world practice is equally varied. This article recaps the latest evidence-based recommendations for the diagnosis and classification of GDM. It reviews the current evidence base for intensive multidisciplinary treatment of GDM and provides recommendations for postpartum management to delay and/or prevent progression to type 2 diabetes

The role of MTHFR polymorphisms in breast cancer risk– A metaanalysis

Breast cancer incidence has been increasing by more than one million new cases every year and is a primary cause of cancer death among women worldwide. Methylenetetrahydrofolate reductase (MTHFR) plays an important role in folate metabolism and as a regulator of DNA methylation, synthesis, and repair. MTHFR gene is polymorphic at nucleotides 677 (C®T) and 1298 (A®C), resulting in allozymes with decreased activity. Several studies have pointed to association between the MTHFR C677T polymorphism and breast cancer risk.info:eu-repo/semantics/publishedVersio

Desenvolvimento e controlo do processo de produção de discos em PET e PP para termoformação

Dissertação de mestrado integrado em Engenharia de PolímerosTipicamente, as empresas de termoformação adquirem folha para produção, ao invés de a extrudir. Este fator leva à geração de desperdício que as empresas, frequentemente, não conseguem reprocessar e/ou conferir o fim de vida devido. Como resposta, surge o projeto da produção de discos (tokens) em PET e PP, correspondentes a “pré-formas”, com a totalidade do material para enformar um copo monopack destinado à indústria alimentar. Fornecendo apenas os discos ao cliente, este passa a não ter desperdício, sendo o resíduo apenas gerado pela Intraplás, que o consegue reaproveitar. Numa primeira fase foi efetuada a análise dos requisitos e especificações do projeto, seguido do planeamento da produção, onde foram definidas as camadas das folhas em função da quantidade possível de incorporação de resíduo gerado do próprio processo. O processamento da folha de PET é habitualmente acompanhado pelo desenvolvimento de eletricidade estática, que pode comprometer o desempenho do produto final. Este fenómeno foi estudado através de medições e comparações de carga elétrica da folha de PET com folha de PP e PS-HIPS. Foi verificado que um dos “fatores chave” para os níveis de eletricidade estática do PET se trata da sua rigidez. Através de estudo numa extrusora laboratorial foi também possível verificar que temperaturas de arrefecimento do PET mais elevadas diminuem este efeito, uma vez que induzem diferenças de rigidez do material à passagem pela calandra. Antecedendo a produção dos discos, foi efetuado o estudo da temperatura ideal de corte de chapas de ambas as matérias-primas. Concluiu-se que o aumento da temperatura favorece a qualidade de corte, nomeadamente a partir dos 60 ºC. Posteriormente, verificou-se que os tokens de PET apresentaram selagem entre si. Este fator levou à incorporação de antiblocking (2 e 4 %) na sua formulação, o que acabou por não se tornar numa solução eficaz, tendo simultaneamente surtido efeitos secundários no material tais como: mudança no comportamento mecânico, perda de transparência e aumento excessivo do empeno. Também se observou que os discos de PET excederam os diâmetros admissíveis para diversas temperaturas de corte. Isto deve-se ao facto de a folha apresentar baixa cristalinidade e não contrair suficientemente. Em contrapartida, a produção dos tokens de PP não apresentou entraves à produção. Por último foi efetuado o estudo de uma nova solução produtiva para o projeto. Concluiu-se que a melhor solução se trata de uma aquisição de uma nova linha termoformadora adaptando um molde para o corte dos discos.Commonly, thermoforming companies acquire sheet for production, instead of extruding it. This factor leads to waste generation whose companies, frequently, do not have the capacity to reprocess and/or give the correct end life. As a solution, emerges the project of the production of PET and PP disks (tokens), corresponding to “pre-forms” with the material’s totality to produce a monopack cup destined to the food industry. By providing only the disks, the clients no longer have waste, being this exclusively generated by Intraplás, who can reuse it. On the project’s first step, an analysis of requirements and specifications was made, followed by the production planning, where the sheet’s layers were delineated in function of the quantity of the process waste available to incorporate. Commonly PET sheet develops static electricity during its processing, which can affect the product’s performance. The phenomenon was studied through measures and comparations of PET electric charge with PP and PS-HIPS sheet. It was verified that one of the key factors to PET levels of static electricity is due to the material’s stiffness. Using a laboratorial extruder, it was possible to verify that higher PET cooling temperatures decrease this phenomenon, since it induces material stiffness differences during calendering. Before disk’s production, an evaluation of the ideal cutting temperature was carried to both materials’ sheet. It was concluded that the increase of temperature favours cutting quality, specially from 60 ºC onwards. During production, PET token’s showed sealing with each other, compromising its performance. This led to the incorporation of antiblocking (2 and 4 %) on the formulation, which turned out to become an inefficient solution since it had secondary effects on PET, such as: change of mechanical behaviour, loss of transparency and excess of warpage. It was also observed that PET’s disks exceeded the acceptable diameters to the temperature range tested. This occurred due to the lack of PET’s sheet crystallinity which made it contract insufficiently. On the other hand, the PP’s tokens were produced without any obstacle. Finally, a study of a new productive solution to the project was carried. It was concluded that the best option is the acquisition of a new thermoforming line that allow the change of mould to cut the disks