Construction, expression, functional characterization and practical application of fusion protein SPA-BAPmut

Aim. The creation of genetically engineered fusion protein SPA-BAPmut and its application as a secondary immunoreagent in immunoassays. Methods. Gene cloning, PCR, electrophoresis, DNA sequencing, bacteria cells culturing, protein expression and purification, ELISA, Western-blotting were used. Results. The DNA sequences encoding Staphylococcus aureus protein A (SPA) and bacterial alkaline phosphatase with enhanced catalytic activity (BAPmut) were used for construction of gene encoding fusion protein SPA-BAPmut that was expressed in the high-productive Escherichia coli system and obtained in a soluble form. Cultivation conditions to provide a high-level expression of SPA-BAPmut (> 1 g/l) were determined. The target protein was obtained with purity more than 95 % using IMAX method. SPA-BAPmut is thermostable, and both parts of fusion protein (SPA and BAPmut) retain their IgG binding and alkaline phosphatase activity for a long time. SPA-BAPmut was used as a substitute of secondary antibodies in immunoassays. As little as 5 ng of the antigen could be detected in Western blotting and 1 g/ml of IgG in ELISA. Conclusions. The possibility of using SPA-BAPmut as universal secondary immunoreagent for different types of immunoassays was shown.Мета. Створення генно-інженерного злитого білка SPA-BAPmut та його застосування як вторинного імунореагенту в імунологічних тестах. Методи. Клонування генів, ПЛР, секвенування ДНК, культивування бактерій, електрофорез, синтез і очищення білків, ELISA, вестерн-блот. Результати. З використанням послідовновностей ДНК, що кодують білок А Staphylococcus aureus (SPA) і бактерійну лужну фосфатазу з покращеними каталітичними властивостями (BAPmut), сконструйовано ген злитого білка SPA-BAPmut та забезпечено його препаративне отримання у розчинній формі внаслідок синтезу в клітинах Escherichia coli. Визначено умови ферментації, за яких вихід SPA-ВAPmut становить приблизно 1 г/л культури E. coli. Із застосуванням методу металоафінної хроматографії одержано цільовий білок з чистотою понад 95 %. SPA-ВAPmut термостабільний, а обидва його компоненти (SPA і ВAPmut) зберігають імуноглобулінзв’язувальну і фосфатазну активність тривалий час. SPA-BAPmut дозволяє виявляти щонайменше 5 нг антигену та 1 мкг/мл антитіл. Висновки. Показано можливість використання SPA-ВAPmut як універсального вторинного імунореагенту в імунохімічних тестах.Цель. Создание генно-инженерного слитого белка SPA-BAPmut и eго использование как вторичного иммунореагента в иммунологических тестах. Методы. Клонирование генов, ПЛР, секвенирование ДНК, культивирование бактерий, электрофорез, биосинтез и очистка белков, ELISA, вестерн-блот. Результаты. С использованием последовательностей ДНК, кодирующих белок А Staphylo- coccus aureus (SPA) и бактериальную щелочную фосфатазу с улучшенными каталитическими свойствами (BAPmut), сконструирован ген слитого белка SPA-BAPmut и обеспечено его препаративное получение в растворимой форме вследствие синтеза в клетках Escherichia coli. Определены условия ферментации, при которых выход SPA-ВAPmut составляет около 1 г/л культуры E. coli. С применением метода металлоаффинной хроматографии целевой белок получен с чистотой более 95 %. SPA-ВAPmut термостабилен, а оба его компонента (SPA и ВAPmut) сохраняют иммуноглобулинсвязывающую и фосфатазную активность на протяжении длительного времени. SPA-BAPmut позволяет детектировать 5 нг антигена и 1 мкг/мл антител. Выводы. Показана возможность применения SPA-ВAPmut как универсального вторичного иммунореагента в иммунохимических тестах

Molecular mechanisms of versatile biological activity of interleukin-7

As a result of immunological studies of the last 25 years it turned out that interleukin-7 (IL-7) is one of the most important regulatory cytokines of the immune system. It is special in many concerns. Having a strong impact on the development, proliferation and activation of immune cells it is, however, cannot be attributed to the classic cytokine-activators, like IL-2, as many types of cells require its presence at almost all stages of the development, and its spectrum of activities is impressive. The review aims to summarise the numerous data obtained on the IL-7 structure, biological activity, biological significance and features of functioning studied both in vitro and in vivo. We made the main emphasis on the IL-7 signal transduction pathways that determine the fate of T and B cells, as well as some other cells important for homeostasis of the organism. In our opinion, the analysis of literature in this field not only reveals a host of questions still unanswered, but also makes the path for perspective investigation more visible.У результаті імунологічних досліджень останніх 25 років показано, що інтерлейкін-7 (ІЛ-7) є одним з найважливіших регуляторних цитокінів імунної системи. Він чинить значний вплив на розвиток, проліферацію і активацію імунних клітин, однак не належить до класичних цитокінів-активаторів, як, наприклад, ІЛ- 2, оскільки багато типів клітин потребують його присутності майже на всіх стадіях розвитку, а спектр його активностей є вражаючим. Цей огляд має на меті узагальнити численні дані щодо структури ІЛ-7, його біологічної активності і особливостей функціонування in vitro та in vivo. Основний акцент зроблено на шляхах сигнальної трансдукції ІЛ-7, які визначають долю Т- і В-клітин, а також деяких інших клітин, важливих для підтримання гомеостазу організму. Аналіз літератури цієї сфери, на нашу думку, не лише виявив низку питань, які наразі не мають відповідей, але й окреслив напрямки для майбутніх досліджень.В результате иммунологических исследований последних 25 лет показано, что интерлейкин-7 (ИЛ-7) является одним из важнейших регуляторных цитокинов иммунной системы. Он оказывает значительное влияние на развитие, пролиферацию и активацию иммунных клеток, онднако не принадлежит к классическим цитокинам-активаторам, как, например, ИЛ-2, поскольку много типов клеток нуждаются в его присутствии почти на всех стадиях своего развития, а спектр его активностей впечатляет. Цель этого обзора состояла в обощении многочисленных данных по структуре ИЛ-7, его биологической активности и особенностям функционирования in vitro и in vivo. Основной акцент сделан на путях сигнальной трансдукции ИЛ-7, определяющих судьбу Т- и В-клеток, а также некоторых других клеток, важных для поддержания гомеостаза организма. Анализ литературы этой сферы, по нашему мнению, не только выявил ряд вопросов, на которые до сих пор нет ответов, но и очертил направления для будущих исследований

Bioaffinity sorbent based on immobilized protein A Staphylococcus aureus: development and application

Цель. Создание биоаффинного сорбента на основе ориентированно иммобилизованного белка А Staphylococcus aureus (SPA) через два целлюлозосвязывающих домена (СBD) Clostridium thermocellum и его применение для очистки антител. Методы. С использованием последовательностей ДНК, кодирующих SPA и два СBD, сконструирован ген слитного белка SPA-CBD2 и обеспечено его получение в растворимой форме экспрессией в клетках Escherichia coli. Целевой белок иммобилизовали методом биоаффинного связывния на микрокристаллической целлюлозе. Результаты. Установлены такие характеристики биоаффинного сорбента, как емкость (1 мг SPA-CBD2 /1 мл целлюлози), динамическая емкость (3 мг иммуноглобулинов мыши/1 мл сорбента) и продуктивность, а также показана его стабильность при долгосрочном хранении. С помощью биоаффинного сорбента выделены фракции иммуноглобулинов с чистотой более 95 %. Определено, что очищенные таким способом антитела с высокой чувствительностью выявляют соответствующие антигены. Выводы. Предложенный биоаффинный сорбент позволяет получать очищенные функционально активные полии моноклональные антитела, а также проводить фракционирование на подклассы иммуноглобулинов G мыши. Ключевые слова: антитела, белок А, целлюлозосвязывающий домен, иммобилизация белка, аффинная хроматография.Мета. Створення біоафінного сорбента на основі орієнтовано іммобілізованого білка А Staphylococcus aureus (SPA) через два целюлозозв’язувальних домени (СBD) Clostridium thermocellum та його застосування для очищення антитіл. Методи. З використанням послідовностей ДНК, кодуючих SPA і два СBD, сконструйовано ген злитого білка SPA-CBD2 та забезпечено його отримання в розчинній формі експресією у клітинах Escherichia coli. Цільовий білок іммобілізовано методом біоафінного зв’язування на мікрокристалічній целюлозі. Результати. Встановлено такі характеристики біоафінного сорбента, як ємність (1 мг SPACBD2/1 мл целюлози), динамічна ємність (3 мг імуноглобулінів миші/1 мл сорбента) і продуктивність, а також показано його стабільність при тривалому зберіганні. За допомогою біоафінного сорбента виділено фракції імуноглобулінів з чистотою понад 95 %. Визначено, що очищені у такий спосіб антитіла з високою чутливістю виявляють відповідні антигени. Висновки. Запропонований біоафінний сорбент дозволяє отримувати очищені функціонально активні поліі моноклональні анттіла, а також проводити фракціонування на підкласи імуноглобулінів G миші. Ключові слова: антитіла, білок А, целюлозозв’язувальний домен, іммобілізація білка, афінна хроматографія.Aim. The obtaining of bioaffinity sorbent based on the immobilized protein A of S. aureus (SPA) using two cellulose-binding domains (CBD), and its application for purification of antibodies. Methods. The DNA sequences encoding SPA and two CBD were genetically fused, expressed in the high-productive Escherichia coli system and the protein SPA-CBD2 was obtained in a soluble form. The SPA-CBD2 fusion protein was affinity immobilized on the microcrystalline cellulose. Results. Capacity of bioaffinity sorbent (1 mg SPA-CBD2/1 ml CC31-cellulose), dynamic capacity (3 mg mouse IgG/1 ml bioaffinity sorbent), efficiency and stability during prolonged storage were determined. The bioffinity sorbent was used for purification of antibodies. The purity of antibodies in eluted fractions was more than 95 %. The purified antibodies detected target antigens with a high sensitivity. Conclusions. The designed bioaffinity sorbent provides obtaining pure poly- and monoclonal antibodies in functionally active form and can be useful for the fractionation of mouse immunoglobulin G. Keywords: antibodies, protein A, cellulose-binding domain, protein immobilization, affinity chromatography

Development of the chromatographic medium for the affinity isolation of the recombinant hIFN-β1b based on immobilized single-chain antibodies

Aim. The development of a laboratory method for the production of immunoaffinity chromatography medium for the purification of the recombinant human IFN-β1b. Methods. A gene of the chimeric protein ScFvbINF-CBD was constructed using the DNA sequences encoding ScFv specific to hIFN-β1b and the cellulose-binding domain (CBD) of Clostridium thermocellum. The developed chimeric protein was expressed in Escherichia coli cells. The target protein was obtained in soluble, functionally active form by its renaturation from the bacterial inclusion bodies in vitro. The ScFvbINF-CBD was immobilized on a chitin carrier. Results. The introduction of CBD by gene engineering techniques enabled the oriented non-covalent immobilization of ScFvbINF-CBD on chromatographic matrix. The developed immunoaffinity medium allowed isolating the rhIFN-β1b from the complex mixture, after its renaturation from the inclusion bodies, with more than 89 % purity. Conclusion. The designed immunoaffinity medium provides isolating the rhIFN-β1b from the complex protein mixtures.Мета. Розробити лабораторний метод створення імуноафінного хроматографічного сорбенту для виділення та очищення рекомбінантного IFN-β1b людини. Методи. Викорис­то­ву­ючи послідовності ДНК, які кодують ScFv специфічні до hIFN-β1b, та целюлозозв’язувальний домен (CBD) Clostri­di­um thermocellum, створено ген химерного протеїну ScFvbINF-CBD. Проведено експресію створеного химерного протеїну в клітинах Escherichia coli. Цільовий білок одержували у розчинній, функціонально активній формі шляхом ренатурації з бактеріальних тілець включення in vitro. ScFvbINF-CBD іммобілізували на хітиновому носії. Результати. Вве­дення CBD до складу химерного білка забезпечує орієнтовану, не ковалентну іммобілізацію ScFvbINF-CBD на хроматографічній матриці. За допомогою створеного імуноафінного сорбенту було виділено rhIFN-β1b зі складної суміші білків, одержаної після його ренатурації з тілець включення, з чистотою більше ніж 89 %. Висновки. Створений імуноафінний хроматографічний сорбент дозволяє виділяти рекомбінантний IFN-β1b людини зі складних сумішей білків.Цель. Разработать лабораторный метод создания иммуноаффинного хроматографического сорбента для выделения и очистки рекомбинантного IFN-β1b человека. Методы. Ис­по­льзуя последовательности ДНК, кодирующие ScFv специ­фичные к hIFN-β1b, и целлюлозосвязывающий домен (CBD) Clostridium thermocellum, создан ген химерного белка ScFvbINF-CBD. Проведена экспрессия созданного химерного белка в клетках Escherichia coli. Целевой белок получали в растворимой, функционально активной форме путем ренатурации из бактериальных телец включения in vitro. ScFvbINF-CBD иммобилизовали на хитиновом носителе. Результаты. Вве­дение CBD в состав химерного белка обеспечивает ориентированную не ковалентную иммобилизацию ScFvbINF-CBD на хроматографической матрице. С помощью созданного иммуносорбента был выделен rhIFN-β1b из сложной смеси белков, полученной после его ренатурации из телец включения, с чистотой более 89 %. Вы­воды. Созданный иммуноаффинный хроматографический сорбент позволяет выделять рекомбинатный IFN-β1b человека из сложных белковых смесей

Recombinant Staphylococcal protein A with cysteine residue for preparation of affinity chromatography stationary phase and immunosensor applications

Aim. Engineering of recombinant Staphylococcal protein A with cysteine residue (SPA-Cys) for preparation of affinity chromatography stationary phase and formation of bioselective element of immunosensor. Methods. DNA sequences encoding IgG-binding region of SPA, His-tag and cysteine were genetically fused and expressed in E. coli. SPA-Cys was immobilized on maleimide-functionalized silica beads for affinity chromatography stationary phase preparation and on a gold sensor surface as a bioselective element of immunosensor. Results. SPA-Cys was expressed at a high-level in a soluble form. The target protein was purified and showed a high IgG-binding activity. The capacity of the obtained SPA-Cys-based affinity chromatography stationary phase was 10–12 mg of IgG /ml. The purity of eluted IgG was more than 95 % in one-step purification procedure. The developed SPA-Cys-based bioselective element of immunosensor selectively interacted with human IgG and did not interact with the control proteins. Conclusions. The recombinant Staphylococcal protein A with cysteine residue was successfully used for the preparation of affinity chromatography stationary phase and formation of the bioselective element of immunosensor.Цель. Получение рекомбинантного белка А Staphylococcus aureus с остатком цистеина (SPA-Cys) и его применение для аффинной хроматографии и формирования биоселективного элемента иммуносенсора. Методы. Генно-инженерными методами конструировали и экспрессировали в E. coli последовательность ДНК, которая кодирует пять IgG-связывающих доменов SPA, His-таг и цистеин. Полученный рекомбинантный белок SPA-Cys иммобилизовали на малеимид-активированных микрогранулах силикагеля для приготовления биоафинного сорбента и на золотой сенсорной поверхности для разработки иммуносенсора. Результаты. Cинтезом в E. coli был получен белок SPA-Cys в растворимой форме с высоким выходом. Очищенный рекомбинантный белок А имеет высокую IgG-связывающую активность. Емкость синтезированного с использованием SPA-Cys биоафинного сорбента составляла 10–12 мг IgG/мл. Одностадийная процедура аффинной хроматографии сыворотки крови позволяет получать IgG с чистотой более 95 %. Показано, что биоселек­тивный элемент иммуносенсора, сформированный на ос­нове SPA-Cys, избирательно взаимодействует с IgG человека и не взаимодействует с контрольными белками. Выво­ды. Рекомбинантный белок SPA-Cys был успешно использован для приготовления стационарной фазы аффинной хро­ма­то­графии и формирования биоселективного элемента иммуносенсора.Мета. Отримання рекомбінантного білка А Staphylococcus aureus із залишком цистеїну (SPA-Cys) та його застосування для афінної хроматографії та формування біоселективного елемента імуносенсора. Методи. Генно-інженерними методами конструювали та експресували в E. coli послідовність ДНК, яка кодує п’ять IgG-зв’язувальних доменів SPA, His-таг і цистеїн. Отриманий рекомбінантний білок SPA-Cys іммобілізували на малеїмід-активованих мікрогранулах силікагелю для приготування біоафінного сорбенту та на золотій сенсорній поверхні для розробки імуносенсора. Результати. Cин­те­зом у E. coli був отриманий білок SPA-Cys в розчинній формі з високим виходом. Очищений рекомбінантний білок А має високу IgG-зв’язувальну активність. Ємність біоафінного сор­бенту з іммобілізованим SPA-Cys складала 10–12 мг IgG/мл. Одностадійна процедура афінної хроматографії сироватки кро­ві дозволяє отримувати IgG з чистотою більш ніж 95 %. По­казано, що біоселективний елемент імуносенсора, сформований на основі SPA-Cys, вибірково взаємодіє з IgG людини і не взаємодіє з контрольними білками. Висновки. Рекомбінантний білок SPA-Cys був успішно використаний для приготування стаціонарної фази афінної хроматографії і формування біоселективного елемента імуносенсора

Small-scale solar magnetic fields

As we resolve ever smaller structures in the solar atmosphere, it has become clear that magnetism is an important component of those small structures. Small-scale magnetism holds the key to many poorly understood facets of solar magnetism on all scales, such as the existence of a local dynamo, chromospheric heating, and flux emergence, to name a few. Here, we review our knowledge of small-scale photospheric fields, with particular emphasis on quiet-sun field, and discuss the implications of several results obtained recently using new instruments, as well as future prospects in this field of research.Comment: 43 pages, 18 figure

Status of NSLS-II booster

The National Synchrotron Light Source II is a third generation light source under construction at Brookhaven National Laboratory. The project includes a highly optimized 3 GeV electron storage ring, linac pre-injector and full-energy booster-synchrotron. Budker Institute of Nuclear Physics builds booster for NSLS-II. The booster should accelerate the electron beam continuously and reliably from minimal 170 MeV injection energy to maximal energy of 3.15 GeV and average beam current of 20 mA. The booster shall be capable of multi-bunch and single bunch operation. This paper summarizes the status of NSLS-II booster.Национальный источник синхротронного излучения II является синхротроном третьего поколения, созданным в Брукхевенской национальной лаборатории. Проект включает: высокооптимизированное накопительное кольцо на 3 ГэВ, линейный ускоритель и бустерный синхротрон на полную энергию. Институт ядерной физики им. Г.И. Будкера создает бустер для NSLS-II. Бустер должен надежно и непрерывно ускорять пучок электронов от минимальной энергии инжекции 170 МэВ до максимальной энергии 3,15 ГэВ с током пучка 20 мА. Бустер должен быть способен работать в односгустковом и многосгустковом режимах. Эта статья суммирует состояние дел по бустеру для NSLS-II.Національне джерело синхротронного випромінювання II є синхротроном третього покоління, створеним у Брукхевенській національній лабораторії. Проект включає: високооптимізоване накопичувальне кільце на 3 ГеВ, лінійний прискорювач і бустерний синхротрон на повну енергію. Інститут ядерної фізики ім. Г.І. Будкера створює бустер для NSLS-II. Бустер повинен надійно і безперервно прискорювати пучок електронів від мінімальної енергії інжекції 170 МеВ до максимальної енергії 3,15 ГеВ зі струмом пучка 20 мА. Бустер повинен бути здатний працювати в односгустковому і багатосгустковому режимах. Ця стаття підсумовує стан справ по бустеру для NSLS-II

Bioaffinity sorbent based on immobilized protein A Staphylococcus aureus: development and application

Цель. Создание биоаффинного сорбента на основе ориентированно иммобилизованного белка А Staphylococcus aureus (SPA) через два целлюлозосвязывающих домена (СBD) Clostridium thermocellum и его применение для очистки антител. Методы. С использованием последовательностей ДНК, кодирующих SPA и два СBD, сконструирован ген слитного белка SPA-CBD2 и обеспечено его получение в растворимой форме экспрессией в клетках Escherichia coli. Целевой белок иммобилизовали методом биоаффинного связывния на микрокристаллической целлюлозе. Результаты. Установлены такие характеристики биоаффинного сорбента, как емкость (1 мг SPA-CBD2 /1 мл целлюлози), динамическая емкость (3 мг иммуноглобулинов мыши/1 мл сорбента) и продуктивность, а также показана его стабильность при долгосрочном хранении. С помощью биоаффинного сорбента выделены фракции иммуноглобулинов с чистотой более 95 %. Определено, что очищенные таким способом антитела с высокой чувствительностью выявляют соответствующие антигены. Выводы. Предложенный биоаффинный сорбент позволяет получать очищенные функционально активные полии моноклональные антитела, а также проводить фракционирование на подклассы иммуноглобулинов G мыши. Ключевые слова: антитела, белок А, целлюлозосвязывающий домен, иммобилизация белка, аффинная хроматография.Мета. Створення біоафінного сорбента на основі орієнтовано іммобілізованого білка А Staphylococcus aureus (SPA) через два целюлозозв’язувальних домени (СBD) Clostridium thermocellum та його застосування для очищення антитіл. Методи. З використанням послідовностей ДНК, кодуючих SPA і два СBD, сконструйовано ген злитого білка SPA-CBD2 та забезпечено його отримання в розчинній формі експресією у клітинах Escherichia coli. Цільовий білок іммобілізовано методом біоафінного зв’язування на мікрокристалічній целюлозі. Результати. Встановлено такі характеристики біоафінного сорбента, як ємність (1 мг SPACBD2/1 мл целюлози), динамічна ємність (3 мг імуноглобулінів миші/1 мл сорбента) і продуктивність, а також показано його стабільність при тривалому зберіганні. За допомогою біоафінного сорбента виділено фракції імуноглобулінів з чистотою понад 95 %. Визначено, що очищені у такий спосіб антитіла з високою чутливістю виявляють відповідні антигени. Висновки. Запропонований біоафінний сорбент дозволяє отримувати очищені функціонально активні поліі моноклональні анттіла, а також проводити фракціонування на підкласи імуноглобулінів G миші. Ключові слова: антитіла, білок А, целюлозозв’язувальний домен, іммобілізація білка, афінна хроматографія.Aim. The obtaining of bioaffinity sorbent based on the immobilized protein A of S. aureus (SPA) using two cellulose-binding domains (CBD), and its application for purification of antibodies. Methods. The DNA sequences encoding SPA and two CBD were genetically fused, expressed in the high-productive Escherichia coli system and the protein SPA-CBD2 was obtained in a soluble form. The SPA-CBD2 fusion protein was affinity immobilized on the microcrystalline cellulose. Results. Capacity of bioaffinity sorbent (1 mg SPA-CBD2/1 ml CC31-cellulose), dynamic capacity (3 mg mouse IgG/1 ml bioaffinity sorbent), efficiency and stability during prolonged storage were determined. The bioffinity sorbent was used for purification of antibodies. The purity of antibodies in eluted fractions was more than 95 %. The purified antibodies detected target antigens with a high sensitivity. Conclusions. The designed bioaffinity sorbent provides obtaining pure poly- and monoclonal antibodies in functionally active form and can be useful for the fractionation of mouse immunoglobulin G. Keywords: antibodies, protein A, cellulose-binding domain, protein immobilization, affinity chromatography

Development of the chromatographic medium for the affinity isolation of the recombinant hIFN-β1b based on immobilized single-chain antibodies

Aim. The development of a laboratory method for the production of immunoaffinity chromatography medium for the purification of the recombinant human IFN-β1b. Methods. A gene of the chimeric protein ScFvbINF-CBD was constructed using the DNA sequences encoding ScFv specific to hIFN-β1b and the cellulose-binding domain (CBD) of Clostridium thermocellum. The developed chimeric protein was expressed in Escherichia coli cells. The target protein was obtained in soluble, functionally active form by its renaturation from the bacterial inclusion bodies in vitro. The ScFvbINF-CBD was immobilized on a chitin carrier. Results. The introduction of CBD by gene engineering techniques enabled the oriented non-covalent immobilization of ScFvbINF-CBD on chromatographic matrix. The developed immunoaffinity medium allowed isolating the rhIFN-β1b from the complex mixture, after its renaturation from the inclusion bodies, with more than 89 % purity. Conclusion. The designed immunoaffinity medium provides isolating the rhIFN-β1b from the complex protein mixtures.Мета. Розробити лабораторний метод створення імуноафінного хроматографічного сорбенту для виділення та очищення рекомбінантного IFN-β1b людини. Методи. Викорис­то­ву­ючи послідовності ДНК, які кодують ScFv специфічні до hIFN-β1b, та целюлозозв’язувальний домен (CBD) Clostri­di­um thermocellum, створено ген химерного протеїну ScFvbINF-CBD. Проведено експресію створеного химерного протеїну в клітинах Escherichia coli. Цільовий білок одержували у розчинній, функціонально активній формі шляхом ренатурації з бактеріальних тілець включення in vitro. ScFvbINF-CBD іммобілізували на хітиновому носії. Результати. Вве­дення CBD до складу химерного білка забезпечує орієнтовану, не ковалентну іммобілізацію ScFvbINF-CBD на хроматографічній матриці. За допомогою створеного імуноафінного сорбенту було виділено rhIFN-β1b зі складної суміші білків, одержаної після його ренатурації з тілець включення, з чистотою більше ніж 89 %. Висновки. Створений імуноафінний хроматографічний сорбент дозволяє виділяти рекомбінантний IFN-β1b людини зі складних сумішей білків.Цель. Разработать лабораторный метод создания иммуноаффинного хроматографического сорбента для выделения и очистки рекомбинантного IFN-β1b человека. Методы. Ис­по­льзуя последовательности ДНК, кодирующие ScFv специ­фичные к hIFN-β1b, и целлюлозосвязывающий домен (CBD) Clostridium thermocellum, создан ген химерного белка ScFvbINF-CBD. Проведена экспрессия созданного химерного белка в клетках Escherichia coli. Целевой белок получали в растворимой, функционально активной форме путем ренатурации из бактериальных телец включения in vitro. ScFvbINF-CBD иммобилизовали на хитиновом носителе. Результаты. Вве­дение CBD в состав химерного белка обеспечивает ориентированную не ковалентную иммобилизацию ScFvbINF-CBD на хроматографической матрице. С помощью созданного иммуносорбента был выделен rhIFN-β1b из сложной смеси белков, полученной после его ренатурации из телец включения, с чистотой более 89 %. Вы­воды. Созданный иммуноаффинный хроматографический сорбент позволяет выделять рекомбинатный IFN-β1b человека из сложных белковых смесей

Recombinant Staphylococcal protein A with cysteine residue for preparation of affinity chromatography stationary phase and immunosensor applications

Aim. Engineering of recombinant Staphylococcal protein A with cysteine residue (SPA-Cys) for preparation of affinity chromatography stationary phase and formation of bioselective element of immunosensor. Methods. DNA sequences encoding IgG-binding region of SPA, His-tag and cysteine were genetically fused and expressed in E. coli. SPA-Cys was immobilized on maleimide-functionalized silica beads for affinity chromatography stationary phase preparation and on a gold sensor surface as a bioselective element of immunosensor. Results. SPA-Cys was expressed at a high-level in a soluble form. The target protein was purified and showed a high IgG-binding activity. The capacity of the obtained SPA-Cys-based affinity chromatography stationary phase was 10–12 mg of IgG /ml. The purity of eluted IgG was more than 95 % in one-step purification procedure. The developed SPA-Cys-based bioselective element of immunosensor selectively interacted with human IgG and did not interact with the control proteins. Conclusions. The recombinant Staphylococcal protein A with cysteine residue was successfully used for the preparation of affinity chromatography stationary phase and formation of the bioselective element of immunosensor.Цель. Получение рекомбинантного белка А Staphylococcus aureus с остатком цистеина (SPA-Cys) и его применение для аффинной хроматографии и формирования биоселективного элемента иммуносенсора. Методы. Генно-инженерными методами конструировали и экспрессировали в E. coli последовательность ДНК, которая кодирует пять IgG-связывающих доменов SPA, His-таг и цистеин. Полученный рекомбинантный белок SPA-Cys иммобилизовали на малеимид-активированных микрогранулах силикагеля для приготовления биоафинного сорбента и на золотой сенсорной поверхности для разработки иммуносенсора. Результаты. Cинтезом в E. coli был получен белок SPA-Cys в растворимой форме с высоким выходом. Очищенный рекомбинантный белок А имеет высокую IgG-связывающую активность. Емкость синтезированного с использованием SPA-Cys биоафинного сорбента составляла 10–12 мг IgG/мл. Одностадийная процедура аффинной хроматографии сыворотки крови позволяет получать IgG с чистотой более 95 %. Показано, что биоселек­тивный элемент иммуносенсора, сформированный на ос­нове SPA-Cys, избирательно взаимодействует с IgG человека и не взаимодействует с контрольными белками. Выво­ды. Рекомбинантный белок SPA-Cys был успешно использован для приготовления стационарной фазы аффинной хро­ма­то­графии и формирования биоселективного элемента иммуносенсора.Мета. Отримання рекомбінантного білка А Staphylococcus aureus із залишком цистеїну (SPA-Cys) та його застосування для афінної хроматографії та формування біоселективного елемента імуносенсора. Методи. Генно-інженерними методами конструювали та експресували в E. coli послідовність ДНК, яка кодує п’ять IgG-зв’язувальних доменів SPA, His-таг і цистеїн. Отриманий рекомбінантний білок SPA-Cys іммобілізували на малеїмід-активованих мікрогранулах силікагелю для приготування біоафінного сорбенту та на золотій сенсорній поверхні для розробки імуносенсора. Результати. Cин­те­зом у E. coli був отриманий білок SPA-Cys в розчинній формі з високим виходом. Очищений рекомбінантний білок А має високу IgG-зв’язувальну активність. Ємність біоафінного сор­бенту з іммобілізованим SPA-Cys складала 10–12 мг IgG/мл. Одностадійна процедура афінної хроматографії сироватки кро­ві дозволяє отримувати IgG з чистотою більш ніж 95 %. По­казано, що біоселективний елемент імуносенсора, сформований на основі SPA-Cys, вибірково взаємодіє з IgG людини і не взаємодіє з контрольними білками. Висновки. Рекомбінантний білок SPA-Cys був успішно використаний для приготування стаціонарної фази афінної хроматографії і формування біоселективного елемента імуносенсора