Protein carbonylation as a mechanism of regulation of MCF-7 breast cancer cell proliferation

Tumor progression is accompanied by dysregulation of cell proliferation and apoptosis, which plays an essential role in breast cancer pathogenesis and cell resistance to chemotherapy. The role of protein carbonylation in molecular mechanisms of regulating MCF-7 breast cancer cell proliferation under the effect of roscovitine, a selective inhibitor of cyclin-dependent kinases, was evaluated. The cells were grown in adherent cell culture with or without roscovitine. The levels of reduced/oxidized glutathione and the concentration of protein carbonyl derivatives were determined by spectrophotometry. The cell cycle was evaluated by the flow cytometry; the same technique was used to measure the reactive oxygen species (ROS) concentration. Cell culture with roscovitine resulted in a decrease in the redox potential of the glutathione system and a rise in the ROS and protein carbonyl derivative concentrations. Roscovitine contributed to the G0/G1 and G2/М phase arrest due to its interaction with ATP-binding sites of cyclin-dependent kinases. Roscovitine could also promote enzyme carbonylation. The obtained results can be further used for development of personalized approaches to breast cancer therapy

Молекулярные механизмы влияния N-этилмалеимида и 1,4-дитиоэритритола на регуляцию апоптоза опухолевых клеток линии Р19 при гипоксии

Relevance. Impairment of apoptosis regulation in P19 cells is correlated with generation of oxidative stress. Under hypoxia, changes in mitochondrial functions occur, which may exacerbate oxidative stress in the tumor cell. The aim of the study was to evaluate the effects of N-ethylmaleimide and 1,4-dithioerythritol on implementation and regulation of apoptosis in P19 cells under hypoxia in vitro.Materials and methods. P19 cells (mouse teratocarcinoma) cultured under hypoxia served as the material for the study. For redox status modulation, 5mM N-ethylmaleimide and 1,4-dithioerythritol in the final concentrations of 5 mM were used. The intracellular concentration of calcium ions, the transmembrane potential and the number of Annexin V, CD95 and CD120 positive cells were determined by flow cytometry. The levels of reduced, oxidized and protein-bound glutathione, protein SH groups, hydroxyl radical and protein carbonyl derivatives were measured by spectrophotometry.Results. The alteration in the redox status of the glutathione system under hypoxia, accompanied by oxidative modification of proteins (glutathionylation and carbonylation), influences the metabolism in the tumor cell on the whole. Under the effects of 1,4-dithioerythritol, an SH group protector, this alteration promotes formation of additional mechanisms to escape apoptosis, whereas under the effects of N-ethylmaleimide, an SH group blocker, it, on the contrary, promotes apoptosis activation.Conclusions. The changes in the redox homeostasis of the tumor cell and modulation of oxidative modification of proteins (glutathionylation and carbonylation) under hypoxia are one of the promising approaches to targeted regulation of cell death.Актуальность. Нарушение регуляции апоптоза в эпителиальных опухолевых клетках линии Р19 сопряжено с формированием окислительного стресса. В условиях гипоксии происходит изменение функционирования митохондрий, что может выступать дополнительным фактором, усугубляющим  окислительный стресс в опухолевой клетке.Цель – оценить влияние N-этилмалеимида и 1,4-дитиоэритритола на реализацию и регуляцию апоптоза опухолевых клеток линии Р19 при гипоксии in vitro.Материалы и методы. Материалом для исследования служили культивированные в условиях гипоксии опухолевые клетки линии Р19 (тератокарцинома мыши). Для модуляции редокс-статуса использовали N-этилмалеимид в концентрации 5 мМ и протектор SH-групп – 1,4-дитиоэритритол в конечнойконцентрации 5 мМ. Методом проточной цитофлуориметрии определяли внутриклеточное содержание ионов кальция, трансмембранный потенциал митохондрий, количество аннексин V-, CD95- и CD120-положительных клеток. Концентрацию восстановленного, окисленного и белково-связанного глутатиона, SH-групп протеинов, гидроксильного радикала и карбонильных производных белков измеряли методом спектрофотомерии.Результаты. В условиях гипоксии изменение редокс-статуса системы глутатиона, сопровождающееся окислительной модификацией белков (глутатионилирование и карбонилирование), оказывает влияние на метаболизм опухолевой клетки в целом и, при применении протектора SH-групп белков – 1,4-дитиоэритритола, способствует формированию дополнительных механизмов ускользания от клеточной гибели, а в случае применения блокатора SH-групп протеинов – N-этилмалеимида – активации апоптоза.Заключение. В условиях гипоксии изменение редокс-гомеостаза опухолевой клетки и модуляция окислительной модификации белков (глутатионилирование и карбонилирование) являются одним из перспективных подходов таргетной регуляции клеточной гибели

Assessment of Animal Sensitivity to Particularly Dangerous Orthopoxviruses, Using Primary Cultures of Lung Cells

Objective of the study is to investigate the sensitivity of different animals to highly pathogenic Orthopoxviruses applying techniques, based on utilization of primary cultures of lung cells, and to assess the possibility of further deployment of this approach. Materials and methods. Cultural and virological research methods are used. Results and conclusions. Performed is the assessment of sensitivity of outbred mice, marmots and chickens to variola virus (VV) and monkeypox virus (MPV), using suspended primary cultures of lung cells (SPCLC) of these animals. Through inoculation of the mentioned above cell cultures with VV and MPV in a dose of 0.00001 PFU per a cell (plaque forming unit /cell) demonstrated has been virus replication with maximum concentration values in all cases (1,4 - 2,0 lg PFU/ml), mainly 3 days after infection. According to the data on SPCLC, sensitivity to VV in mice, marmots and chickens (ID50 - 50 % infective dose) amounts to (1,3 ± 0,5) lg PFU; (2,3 ± 0,5) lg PFU; and (0,0 ± 0,4) lg PFU respectively, taking into account unhindered interaction of the virus with permissive lung cells in the organism of the animals. As for MPV values for this indicator, they are: (1,7 ± 0,3) lg PFU for mice, and (0,5 ± 0,3) lg PFU - for marmots. Obtained ID50 values for VV using mice SPCLC and for MPV using mice and marmots SPCLC coincide with the ones, studied in direct experiments on intranasal infection with the viruses, with regard to 10 % of the viral application in lungs when deploying the latter method of infection. The fact testifies to the possibility of further deployment of this method for the assessment of animal sensitivity to highly pathogenic Orthopoxviruses based on the results of in vitro experiments

РОЛЬ ОКИСЛИТЕЛЬНОЙ МОДИФИКАЦИИ БЕЛКОВ В РЕДОКС-РЕГУЛЯЦИИ АКТИВНОСТИ КАСПАЗЫ-3 В ЛИМФОЦИТАХ КРОВИ ПРИ ОКИСЛИТЕЛЬНОМ СТРЕССЕ IN VITRO

The formation of oxidative stress lies at the heart of many frequent and socially-important diseases. Blood lymphocytes are the cells which provide immunological control of our organism. As a result of their function implementation blood lymphocytes contact with different endogenic and exogenic factors, which can lead to active oxygen species production activation, macromolecules oxidative modification and to cell survival alteration. At the present time it is essential to expand and deepen the fundamental knowledge of blood lymphocytes apoptosis regulation peculiarities. The research objective was to establish the interaction among alterations of glutathione system condition, carbonylation level, protein glutathionylation and caspase-3 activity in blood lymphocytes during oxidative stress in vitro.Material and Methods. The material for research was blood lymphocytes cultivated with addition of hydrogen peroxide in final concentration of 0,5 mmol and/or protein SH-group inhibitor N-ethylmaleimide – 5 mmol, protector – 5 mmol – 1,4-dithioerythritol. Reduced, oxidized and protein-bound glutathione concentration was measured by method of spectropho-tometry, additionally, the ratio size of reduced to oxidized thiol fraction was estimated. With help of enzymoimmunoassay the level of protein carbonyl derivatives was evaluated; caspase-3 activity was registered by spectrofluorometric method.Results. Protein SH-group blocking in blood lymphocytes during oxidative stress in vitro was accompanied by protein-bound glutathione concentration rapid decrease in connection with increase of protein carbonyl derivatives content and caspase-3 activity. Protein SH-group protection in blood lymphocytes during oxidative stress in vitro was accompanied by concentration increase of protein-bound glutathione and protein carbonyl derivatives under comparable values of enzyme activity under study.Conclusion. The carried out research shows that caspase-3 and protein-bound glutathione are the molecular targets of selective control over programmed cell death. The received indices of caspase-3 activity change and protein-bound glutathione concentration alteration in blood lymphocytes during oxidative stress in vitro can be used when elaborating target therapy approaches to diseases accompanied by apoptosis disregulation.В основе патогенеза многих распространенных и социально-значимых заболеваний лежит формирование окислительного стресса. Лимфоциты крови являются клетками, обеспечивающими иммунологический контроль организма. В результате происходит контакт лимфоцитов крови с различными эндогенными и экзогенными факторами, что может приводить к интенсификации продукции активных форм кислорода, окислительной модификации макромолекул и изменению выживаемости клеток. Актуальным является расширение и углубление фундаментальных знаний об особенностях регуляции апоптоза лимфоцитов крови.Цель исследования – установить взаимосвязь между изменением состояния системы глутатиона, уровнем карбонилирования, глутатионилирования белков и активностью каспазы-3 в лимфоцитах крови при окислительном стрессе in vitro.Материалы и методы. Материалом для исследования служили лимфоциты крови, культивированные с добавлением пероксида водорода в конечной концентрации 0,5 ммоль и (или) блокатора SH-групп протеинов N-этилмалеимида – 5 ммоль, протектора – 5 ммоль – 1,4-дитиоэритритола. Методом спектрофотометрии определяли концентрацию восстановленного, окисленного и белковосвязанного глутатиона, дополнительно рассчитывали величину соотношения восстановленной фракции тиола к окисленной. С помощью иммуно-ферментного анализа оценивали уровень карбонильных производных протеинов, активность каспазы-3 регистрировали спектрофлюориметрическим методом.Результаты. Блокирование SH-групп протеинов в лимфоцитах крови при окислительном стрессе in vitro сопровождалось резким падением концентрации белково-связанного глутатиона на фоне увеличения содержания карбонильных производных белков и активности каспазы-3. Протекция SH-групп белков в лимфоцитах крови при окислительном стрессе in vitro сопровождалась возрастанием концентрации белково-связанного глутатиона, карбонильных производных протеинов при сопоставимых значениях активности изучаемого фермента.Выводы. Проведенные исследования свидетельствуют о том, что каспаза-3 и белково-связанный глутатион являются молекулярными мишенями селективного управления программированной клеточной гибелью. Полученные показатели изменения активности каспазы-3 и концентрации белково-связанного глутатиона в лимфоцитах крови при окислительном стрессе in vitro могут быть использованы при разработке подходов таргетной терапии заболеваний, сопровождающихся дисрегуляцией апоптоза

Убиквитин и регуляция апоптоза опухолевых клеток линии Jurkat

Introduction. One of the crucial tasks in medicine is studying the molecular mechanisms of selective management of tumor cell apoptosis following conformational changes in protein molecules (ubiquitination).The purpose of the study. The aim of the project is to establish the role of ubiquitin and ubiquitinligase in dexamethasone-induced apoptosis in Jurkat cells.Materials and methods. The study was carried out on the Jurkat tumor cell line (intact cells and cells cultured in the presence of an apoptosis inducer dexamethasone in the final concentration of 10 µmol. In intact and dexamethasone-affected Jurkat cells, implementation of apoptosis and the amount of FAS-, TNF Receptor 1 and cells with reduced mitochondrial membrane potential were assessed by flow cytometry using FITC-conjugated Annexin V and Propidium Iodide. The levels of NF-κB, Apaf-1, ubiquitin and ubiquitin ligase were determined by Western blot analysis. The activity of caspase-3 was measured by spectrofluorometry.Results. When adding the apoptosis inducer dexamethasone to the Jurkat cell culture, we registered a fall in the concentration of ubiquitin and a rise in the level of ubiquitinligase against the backdrop of activated receptor(an increase in the amount of Annexin V positive cells, FASand TNF Receptor 1) and mitochondrialmediated (an increase in the number of cells with reduced mitochondrial membrane potential and elevation of Apaf-1 level) pathways of apoptosis, as opposed to the intact cell culture. We estimated the completion of apoptosis by determining the activity of caspase-3 in the investigated tumor cells.Conclusion. The obtained findings allow the conclusion that ubiquitination of regulatory and effector proteins in programmed cell death is one of the molecular mechanisms that regulates and selectively controls apoptosis in Jurkat cells.Актуальность. Одной из актуальных задач медицины является изучение молекулярных механизмов селективного управления апоптотической гибелью опухолевых клеток в результате конформационных изменений белковых молекул (убиквитинилирования). Цель исследования: установить роль убиквитина и убиквитинлигазы в дексаметазон-индуцированном апоптозе опухолевых клеток линии Jurkat.Материалы и методы. Интактные и культивированные при дополнительном добавлении индуктора апоптоза дексаметазона в конечной концентрации 10 мкМ опухолевые клетки линии Jurkat. Методом проточной цитофлуориметрии в интактных опухолевых клетках линии Jurkat и после предварительного воздействия дексаметазоном проводили оценку реализации апоптоза с использованием FITС-меченного аннексина V и пропидия иодида, количества FASи TNF-рецептор 1 положительных клеток со сниженным митохондриальным потенциалом. Методом вестерн-блоттинга определяли содержание транскрипционных факторов NF-κB, Apaf-1; убиквитина и убиквитинлигазы; активность каспазы-3 регистрировали спектрофлуориметрическим методом.Результаты. При добавлении дексаметазона – индуктора апоптоза – в среду культивирования опухолевых клеток линии Jurkat установлено снижение концентрации убиквитина и возрастание содержания убиквитинлигазы на фоне активации рецепторного (увеличение доли аннексин-, FASи TNFрецептор 1 положительных клеток) и митохондриального (возрастание числа клеток со сниженным митохондриальным потенциалом и содержания транскрипционного фактора Apaf-1) путей апоптоза по сравнению с интактной культурой опухолевых клеток. Завершенность апоптоза оценивали, определяя активность каспазы-3 в изучаемых клетках.Выводы. Полученные результаты позволяют сделать вывод о том, что процесс убиквитинилирования белков-регуляторов и белков-эффекторов программированной гибели является одним из молекулярных механизмов регуляции апоптоза опухолевых клеток линии Jurkat

ИЗМЕНЕНИЕ СИСТЕМЫ ГЛУТАТИОНА В КЛЕТКАХ ОПУХОЛЕВОЙ ЛИНИИ Р19 ПРИ ГИПОКСИИ

Introduction. According to modern perceptions, tumor growth, along with oxidative stress formation, is accompanied by hypoxia. Nowadays studying the regulation of cellular molecular system functioning by conformational changes in proteins appears to be a topical issue. Research goal was to evaluate the state of the glutathione system and the level of protein glutathionylation in P19 embryonal carcinoma (EC) cells under hypoxic conditions.Material and methods. P19 EC cells (mouse embryonal carcinoma) cultured under normoxic and hypox-ic conditions served the research material.The concentration of total, oxidized, reduced and protein-bound glutathione, the reduced to oxidized thiol ratio as well as glutathione peroxidase and glutathione reductase activity were determined by spectropho-tometry.Results. Glutathione imbalance was accompanied by a decrease in P19 EC cell redox status under hypox-ic conditions against the backdrop of a rise in protein-bound glutathione.Conclusions. As a result of the conducted study oxidative stress formation was identified when modeling hypoxia in P19 embryonal carcinoma cells. The rise in the concentration of protein-bound glutathione may indicate the role of protein glutathionylation in regulation of P19 cell metabolism and functions un-der hypoxia. Введение. Согласно современным представлениям, опухолевый рост, наряду с формированием окислительного стресса, сопровождается гипоксией. В настоящее время актуальным является изучение регуляции функционирования молекулярных систем клеток с помощью конформационных изменений белков.Цель исследования – оценить состояние системы глутатиона и уровень глутатионилирования бел-ков в опухолевых клетках линии Р19 при гипоксии.Материал и методы. Материалом для исследования служили опухолевые клетки линии Р19 (тератокарцинома мыши), культивированные в условиях нормоксии и гипоксии. Методом спектрофотометрии определяли концентрацию общего, окисленного, восстановленного и белково-связанного глутатиона, величину соотношения восстановленной фракции тиола к окисленной, а также активность глутатионпероксидазы и глутатионредуктазы.Результаты. Дисбаланс системы глутатиона сопровождался снижением редокс-статуса опухолевых клеток линии Р19 в условиях гипоксии на фоне увеличения содержания белково-связанного глутатиона.Заключение. В результате проведенного исследования установлено формирование окислительно-го стресса при моделировании гипоксии в опухолевых клетках линии Р19. Увеличение содержания белково-связанного глутатиона может свидетельствовать об участии процесса глутатионилирования протеинов в регуляции метаболизма и функций опухолевых клеток линии Р19 при гипоксии

ОКИСЛИТЕЛЬНАЯ МОДИФИКАЦИЯ БЕЛКОВ И СИСТЕМА ГЛУТАТИОНА В АДИПОЦИТАХ ПРИ САХАРНОМ ДИАБЕТЕ

Currently, diabetes ranks third in relation to medical and social significance after cardiovascular diseases and cancer and is the leading cause of blindness; it greatly increases the risk of myocardial infarction, coronary heart disease, nephropathy and hypertension in patients with this disorder; therefore clinical and experimental studies aimed at investigation of diabetes emergence and development mechanisms are urgent.The aim of the study was to investigate the status of oxidative modification of proteins and glutathionedependent antioxidant defense system in adipocytes of rats with alloxan diabetes under conditions of oxidative stress.Material and methods. Development of type 1 diabetes was induced in rats by alloxan administration (90 mg/kg of body mass). Adipocytes were obtained from epididymal adipose tissue of rats. The level of carbonyl derivatives of proteins, oxidized tryptophan, bityrosine, general, reduced, oxygenated and protein-bound glutathione, as well as glutathione peroxidase activity in adipocytes of rats was determined.Results. In adipocytes of rats with alloxan diabetes, concentration of carbonyl derivatives of proteins, bityrosine and oxidized tryptophan increased on the background of redox-potential of glutathione system and glutathione peroxidase activity decrease.Conclusion. The obtained data indicate the activation of free-radical oxidation of proteins and reduction of antioxidant defense under conditions of oxidative stress in the adipose tissue of rats with alloxan diabetes; this process plays an important role in pathogenesis of diabetes and its complications development.В настоящее время в структуре заболеваний сахарный диабет (СД) занимает третье место после сердечно-сосудистых и онкологических заболеваний и является главной причиной слепоты, значительно повышает риск развития инфаркта миокарда, ишемической болезни сердца, нефропатий, гипертонии у пациентов с данной патологией, в связи с чем актуальны клинические и экспериментальные исследования, направленные на изучение механизмов возникновения и развития СД.Целью исследования являлось изучение состояния окислительной модификации белков и глутатион-зависимой системы антиоксидантной защиты в адипоцитах и плазме крови крыс с аллоксановым диабетом в условиях окислительного стресса.Материал и методы. У крыс индуцировали развитие СД 1-го типа введением аллоксана (90 мг/кг массы тела). Плазму крови и адипоциты получали из эпидидимальной жировой ткани крыс, определяли содержание карбонильных производных белков, окисленного триптофана, битирозина, общего, восстановленного, окисленного и белковосвязанного глутатиона, активность глутатионпероксидазы.Результаты. В адипоцитах и плазме крови крыс с аллоксановым диабетом увеличивалась концентрация карбонильных производных белков, битирозина и окисленного триптофана на фоне снижения редокс-потенциала системы глутатиона и активности глутатионпероксидазы.Заключение. Полученные данные свидетельствуют об активации свободнорадикального окисления белков и снижении антиоксидантной защиты в условиях окислительного стресса в жировой ткани крыс с аллоксановым диабетом, что играет важную роль в патогенезе СД и развитии его осложнений

МЕХАНИЗМЫ ДИЗРЕГУЛЯЦИИ АПОПТОЗА ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК ЛИНИИ Р19 В УСЛОВИЯХ МОДУЛЯЦИИ РЕДОКС-СТАТУСА

Introduction. Changes in the redox status of tumor cells can be used as one of the molecular mechanisms of apoptosis aimed at increasing the susceptibility of tumor cells to chemotherapeutic agents. Purpose: to study the mechanisms of dysregulation of apoptosis in P19 tumor cells under the conditions of redox status modulation. Material and methods. Apoptosis in P19 tumor cells was assessed by flow cytometry analysis. The number of annexin-positive cells, the expression of CD95 and CD120, as well as the intracellular calcium ion concentration and the percentage of cells with reduced mitochondrial transmembrane potential were measured. The protein-glutathione mixed-disulfide level and the GSH/GSSG ratio were determined by spectrophotometry. To modulate redox status of cells, the protector and blocker of SH-groups, or N-acetylcysteine were used. Results. Incubation of cultures in the presence of SH-group blocker resulted in the imbalance in the glutathione system with increased concentration of glutathionylated proteins. A decreased redox status led to an increased CD95 and CD120 expression levels on the membrane of P19 tumor cells, as well as to decreased mitochondrial potential and increased intracellular calcium ion concentration, thus contributing to the launch of a P19 tumor cells. The presence of SH-group blocker and N-acetylcysteine resulted in an increased number of annexinpositive cells. Conclusion. Along with the development of oxidative stress, the molecular redox-dependent mechanisms of apoptosis dysregulation through the mitochondrial and receptor-mediated pathways were identified in the P19 tumor cells.Введение. Изменение редокс-статуса опухолевых клеток может использоваться как один из молекулярных механизмов регуляции апоптоза, нацеленный на повышение восприимчивости опухолевых клеток к действию химиотерапевтических агентов. Цель исследования – изучение механизмов дизрегуляции апоптоза опухолевых клеток линии Р19 в условиях модуляции редокс-статуса. материал и методы. В ходе проведенного исследования комплексную оценку апоптоза в клетках опухолевой линии Р19 осуществляли методом проточной цитофлюориметрии. Определяли количество аннексинположительных клеток, экспрессию CD95 и CD120, а также процент клеток со сниженным трансмембранным потенциалом и внутриклеточную концентрацию ионов кальция. Содержание белковосвязанного глутатиона и величину соотношения восстановленной формы трипептида к окисленной определяли спектрофотометрическим методом. Для модуляции редокс-статуса использовали блокатор или протектор SH-групп, либо N-ацетилцистеин. результаты. Инкубация культуры в присутствии блокатора SH-групп приводила к дисбалансу системы глутатиона на фоне увеличения содержания его фракции, связанной с белками. Снижение редокс-статуса приводило к увеличению экспрессии CD95 и CD120 на мембране опухолевых клеток линии Р19, а также к снижению митохондриального потенциала и повышению внутриклеточной концентрации ионов кальция, что способствовало запуску апоптоза. Количество аннексин-положительных клеток увеличивалось при действии блокатора SH-групп и в присутствии N-ацетилцистеина. Заключение. В опухолевых клетках линии Р19 на фоне развития окислительного стресса выявлены молекулярные редокс-зависимые механизмы дизрегуляции апоптоза по митохондриальному и рецепторопосредованному пути