Determination of the LOQ in real-time PCR by receiver operating characteristic curve analysis: application to qPCR assays for Fusarium verticillioides and F. proliferatum

Real-time PCR (qPCR) is the principal technique for the quantification of pathogen biomass in host tissue, yet no generic methods exist for the determination of the limit of quantification (LOQ) and the limit of detection (LOD) in qPCR. We suggest using the Youden index in the context of the receiver operating characteristic (ROC) curve analysis for this purpose. The LOQ was defined as the amount of target DNA that maximizes the sum of sensitivity and specificity. The LOD was defined as the lowest amount of target DNA that was amplified with a false-negative rate below a given threshold. We applied this concept to qPCR assays for Fusarium verticillioides and Fusarium proliferatum DNA in maize kernels. Spiked matrix and field samples characterized by melting curve analysis of PCR products were used as the source of true positives and true negatives. On the basis of the analysis of sensitivity and specificity of the assays, we estimated the LOQ values as 0.11 pg of DNA for spiked matrix and 0.62 pg of DNA for field samples for F. verticillioides. The LOQ values for F. proliferatum were 0.03 pg for spiked matrix and 0.24 pg for field samples. The mean LOQ values correspond to approximately eight genomes for F. verticillioides and three genomes for F. proliferatum. We demonstrated that the ROC analysis concept, developed for qualitative diagnostics, can be used for the determination of performance parameters of quantitative PCR

Besiedlung und Mykotoxinbildung durch Fusarium spp. in Mais

Kolbenfusariosen verursacht durch Pilze der Gattung Fusarium spp. stellen ein ernstes Problem beim Maisanbau weltweit dar. Diese Krankheit wird in zwei Typen unterteilt: Gibberella Kolbenfäule (Gibberella ear rot, GER) und Fusarium Kolbenfäule (Fusarium ear rot, FER). Kolbenfäule verursacht nicht nur Ertragsausfälle, sondern schädigt vor allem durch hohe Qualitätseinbußen beim Erntegut. Diese kommen durch die Anreicherung von Mykotoxinen zustande, welche stark gesundheitsschädlich für Menschen und Tiere sind. In Deutschland sind vor allem die Toxine Deoxynivalenol, Zearalenon sowie Fumonisine von Bedeutung. Deoxynivalenol und Zearalenon werden von dem Pilz F. graminearum produziert, dem wichtigsten Erreger der Gibberella Kolbenfäule. Fumonisine dagegen werden von F. verticillioides und F.proliferatum produziert, den Haupterregern der Fusarium Kolbenfäule. Der spezies-spezifische quantitative Nachweis der Biomasse der einzelnen Erreger der Kolbenfusariosen ist für epidemiologische Fragestellungen unabdingbar. Bereits in vorangegangene Arbeiten wurden Real-time PCR Assays für den spezifischen quantitativen Nachweis von F. verticillioides und F. proliferatum etabliert. Für diese beiden Assays wurde in der vorliegenden Arbeit mittels der ROC (Receiver Operation Characteristic Curve)-Analyse der Zusammenhang zwischen Spezifität und Sensitivität untersucht und der optimale Schwellenwert für den Nachweis dieser beiden Pathogene ermittelt. Mais wird in Deutschland zu einem großen Teil als Viehfutter angebaut. Dafür wird oft die gesamte Pflanze zu Silage verarbeitet und dann verfüttert. Aus diesem Grund wurde die Ausbreitung von F. graminearum und die Belastung mit Mykotoxinen von dem inokulierten Kolben ausgehend in den Stängel oberhalb und unterhalb des Kolbens untersucht. Um den Einfluss des Erntezeitpunktes auf die Verlagerung zu untersuchen, wurde die Belastung mit Pilzmyzel und Mykotoxinen zum früheren Ermtezeitpunkt der Silagereife und zur späteren Zeitpunkt der Körnermaisreife erfasst. Es wurde nachgewiesen, daß es zur Silagereife kaum eine Ausbreitung von Pilzmyzel und Mykotoxinen in den Stängel gibt, allerdings konnten zur Körnermaisreife Mykotoxine im Stängel unterhalb und oberhalb des inokulierten Kolbens nachgewiesen worden. Ein Zusammenhang zwischen den Kolbenfäule-Symptomen und der Mykotoxinbelastung der Stängel konnte allerdings nicht gefunden werden. Da sowohl F. graminearum als auch F. verticillioides regelmäßig in Deutschland in Mais nachgewiesen werden können, wurde die Interaktion zwischen diesen beiden Pilzen nach gleichzeitiger Injektion in den Kolben in einer Zeitreihe untersucht. Während F. verticillioides von der Co-Inokulation mit F. graminearum nicht beeinflußt wurde, wurde das Wachstum von F. graminearum durch F. verticillioides erheblich gehemmt. Die Dynamik der Mykotoxinproduktion zeigte, daß Deoxynivalenol und Fumonisine bereits früh im Lauf der Pathogenese gebildet werden, während Zearalenon erst später gebildet wird. Dies deutet darauf hin dass Zearalenon möglicherweise nicht in den Besiedelungsprozeß involviert ist. Fusarium spp. überdauert in Stoppeln und Pflanzenresten, daher besteht die Möglichkeit eines Einflusses von Bodenbearbeitung und Fruchtfolge auf das Auftreten von Kolbenfusariosen. Da es unterschiedliche Bearbeitungsstrategien im ökologischen und konventionellen Maisanbau gibt, wurde ein dreijähriger Anbauvergleich durchgeführt, bei dem unterschiedliche Mais-Genotypen gleichzeitig unter konventionellen und ökologischen Bedingungen angebaut wurden, und der Befall mit Kolbenfusariosen verglichen wurde. Es konnten keine Unterschiede zwischen den beiden Anbausystemen hinsichtlich der Belastung mit Pilzbiomasse und Mykotoxinen festgestellt werden, die eindeutig nur der unterschiedlichen Anbauweise zugeschrieben werden konnte