Μελέτη του ρόλου των επιγενετικών μηχανισμών και των μηχανισμών μεταγωγής σήματος στη ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης: η λειτουργία των CS πρωτεϊνών

Η μελέτη μας αρχικά επικεντρώθηκε στον τρόπο με τον οποίο τα φυσιολογικά κύτταρα αποκρίνονται στις βλάβες που προκαλεί η υπεριώδης ακτινοβολία στο γονιδίωμα και οι οποίες διακόπτουν την πορεία την μεταγραφή. Βρέθηκε ότι αμέσως μετά την επαγωγή βλαβών ξεκινά η ταυτόχρονη απελευθέρωση RNA πολυμερασών II επιμήκυνσης από τις θέσεις παύσης της μεταγραφής πλησίον των υποκινητών (Promoter proximal pausing sites) προς το 3’ άκρο όλων των ενεργά μεταγραφόμενων γονιδίων. Με τον τρόπο αυτόν οι RNA πολυμεράσες, οι οποίες κινούνται κατά μήκος των ενεργών γονιδίων, μεταγράφοντάς τα, μεγιστοποιούν τις πιθανότητες να συναντήσουν κάποια βλάβη και να ενεργοποιήσουν άμεσα το υπεύθυνο μονοπάτι επιδιόρθωσης, συντελώντας με τον τρόπο αυτό στην επιτάχυνση της απομάκρυνσής τους. Μια σημαντική συνέπεια του μεταγραφικού αυτού μηχανισμού άμυνας είναι η ομογενής μείωση των μεταλλάξεων σε όλα σχεδόν τα εκφρασμένα γονίδια, όπως βρέθηκε μετά από αλληλούχιση γονιδιωμάτων που είχαν εκτεθεί σε τοξικούς παράγοντες όπως το μελάνωμα και το αδενοκαρκίνωμα του πνεύμονα. Τα αποτελέσματα της ενότητας αυτής έχουν δημοσιευθεί πρόσφατα (Lavigne et al., Nature Communications 2017). Στη συνέχεια μελετήθηκε η απόκριση των κυττάρων που φέρουν μεταλλαγή στο ERCC6 γονίδιο (κωδικοποιεί για την CSB πρωτεΐνη), ώστε να αποσαφηνιστεί ο ρόλος της πρωτεΐνης στη ρύθμιση της μεταγραφής πριν και μετά από την επίδραση γενοτοξικών παραγόντων. Χρησιμοποιώντας αλληλούχιση νεοσυντιθέμενων τμημάτων RNA βρήκαμε, σε αντίθεση με ότι πιστεύονταν, ότι και στα CS-B κύτταρα ξεκινά ένα νέο κύμα μεταγραφής στα αρχικά στάδια έπειτα από επίδραση υπεριώδους ακτινοβολίας, το οποίο όμως είναι πολύ πιο αργό από αυτό που παρατηρείται στα φυσιολογικά κύτταρα. Η μειωμένη ταχύτητα μεταγραφής που παρατηρείται απουσία λειτουργικής CSB πρωτεΐνης οφείλεται πιθανά στην εκτεταμένη παρακώλυση των RNA πολυμερασών στα σημεία DNA βλαβών λόγω της ελαττωματικής επιδιόρθωσης τους σε αυτά τα κύτταρα. Ενώ, η έναρξη της μεταγραφής φαίνεται ότι δεν επηρεάζεται, οι πολυμεράσες επιμήκυνσης παραμένουν μόνιμα παγιδευμένες στα αρχικά τμήματα των γονιδίων και δεν επιτρέπουν την επανάκαμψη της επιμήκυνσης της μεταγραφής, με αποτέλεσμα την απώλεια ζωτικών μεταγράφων και την ενεργοποίηση μηχανισμών απόπτωσης των CS-B κυττάρων. Τα αποτελέσματα της 2ης ενότητας έχουν συμπεριληφθεί σε μια δημοσίευση η οποία είναι στο στάδιο υποβολής σε διεθνές επιστημονικό περιοδικό (Ntakou-Zamplara et al.).In this study we focused on complex molecular responses that preserve gene expression accuracy and genome integrity in the face of UV irradiation. We revealed a new mechanism in response to UV , in which RNA polymerase II (RNAPII) molecules are dynamically and synchronously released from promoter-proximal pausing sites (PPP) into elongation to promote uniform and accelerated surveillance of the whole transcribed genome. The maximised influx of de novo released RNAPII correlates with increased damage-sensing. In turn, this transcription elongation ‘safe’ mode guarantees efficient DNA repair regardless of damage location, gene size and transcription level. Accordingly, we detect low and homogenous rates of mutational signatures associated with UV exposure or cigarette smoke across all active genes. Our results were recently published (Lavigne et al., Nature Communications 2017). Moreover, aiming to shed light on the role of Cockayne Syndrome protein B (CSB) protein in transcription reorganization after damage, we studied the response of cells with defective CSB to UV irradiation. Using nascent RNA sequencing, we revealed a new wave of transcription released from PPP as an early response to UV in contrast to previous studies. This de novo wave is characterized by a slower rate in comparison to normal cells possibly due to the blockage of RNAPII molecules at damaged sites. Whereas the initiation of transcription seems unaffected, the elongating polymerases remain trapped in areas close to the 5’ prime end of long genes, preventing the recovery of transcription. As a result, Cockayne Syndrome cells lacking vital transcripts eventually activate apoptotic pathways. The results of the second part of this study are included in a manuscript which is under submission for publication (Ntakou-Zamplara et al.)

The role of epigenetics and signal transduction in the regulation of gene expression: the function of Cockayne Syndrome proteins

In this study we focused on complex molecular responses that preserve gene expression accuracy and genome integrity in the face of UV irradiation. We revealed a new mechanism in response to UV , in which RNA polymerase II (RNAPII) molecules are dynamically and synchronously released from promoter-proximal pausing sites (PPP) into elongation to promote uniform and accelerated surveillance of the whole transcribed genome. The maximised influx of de novo released RNAPII correlates with increased damage-sensing. In turn, this transcription elongation ‘safe’ mode guarantees efficient DNA repair regardless of damage location, gene size and transcription level. Accordingly, we detect low and homogenous rates of mutational signatures associated with UV exposure or cigarette smoke across all active genes. Our results were recently published (Lavigne et al., Nature Communications 2017). Moreover, aiming to shed light on the role of Cockayne Syndrome protein B (CSB) protein in transcription reorganization after damage, we studied the response of cells with defective CSB to UV irradiation. Using nascent RNA sequencing, we revealed a new wave of transcription released from PPP as an early response to UV in contrast to previous studies. This de novo wave is characterized by a slower rate in comparison to normal cells possibly due to the blockage of RNAPII molecules at damaged sites. Whereas the initiation of transcription seems unaffected, the elongating polymerases remain trapped in areas close to the 5’ prime end of long genes, preventing the recovery of transcription. As a result, Cockayne Syndrome cells lacking vital transcripts eventually activate apoptotic pathways. The results of the second part of this study are included in a manuscript which is under submission for publication (Ntakou-Zamplara et al.).Η μελέτη μας αρχικά επικεντρώθηκε στον τρόπο με τον οποίο τα φυσιολογικά κύτταρα αποκρίνονται στις βλάβες που προκαλεί η υπεριώδης ακτινοβολία στο γονιδίωμα και οι οποίες διακόπτουν την πορεία της μεταγραφής. Βρέθηκε ότι αμέσως μετά την επαγωγή βλαβών ξεκινά η ταυτόχρονη απελευθέρωση RNA πολυμερασών II επιμήκυνσης από τις θέσεις παύσης της μεταγραφής πλησίον των υποκινητών (Promoter proximal pausing sites) προς το 3’ άκρο όλων των ενεργά μεταγραφόμενων γονιδίων. Με τον τρόπο αυτόν οι RNA πολυμεράσες, οι οποίες κινούνται κατά μήκος των ενεργών γονιδίων, μεταγράφοντάς τα, μεγιστοποιούν τις πιθανότητες να συναντήσουν κάποια βλάβη και να ενεργοποιήσουν άμεσα το υπεύθυνο μονοπάτι επιδιόρθωσης, συντελώντας με τον τρόπο αυτόν στην επιτάχυνση της απομάκρυνσής τους. Μια σημαντική συνέπεια του μεταγραφικού αυτού μηχανισμού άμυνας είναι η ομοιογενής μείωση των μεταλλάξεων σε όλα σχεδόν τα εκφραζόμενα γονίδια, όπως βρέθηκε μετά από αλληλούχιση γονιδιωμάτων που είχαν εκτεθεί σε τοξικούς παράγοντες, όπως το μελάνωμα και το αδενοκαρκίνωμα του πνεύμονα. Τα αποτελέσματα της ενότητας αυτής έχουν δημοσιευθεί πρόσφατα (Lavigne et al., Nature Communications 2017). Στη συνέχεια μελετήθηκε η απόκριση των κυττάρων που φέρουν μεταλλαγή στο ERCC6 γονίδιο (κωδικοποιεί για την CSB πρωτεΐνη), ώστε να αποσαφηνιστεί ο ρόλος της πρωτεΐνης στη ρύθμιση της μεταγραφής πριν και μετά από την επίδραση γενοτοξικών παραγόντων. Χρησιμοποιώντας μεθόδους αλληλούχισης νεοσυντιθέμενων τμημάτων RNA βρήκαμε, σε αντίθεση με ότι πιστεύονταν, ότι και στα CS-B κύτταρα ξεκινά ένα νέο κύμα μεταγραφής στα αρχικά στάδια έπειτα από επίδραση υπεριώδους ακτινοβολίας, το οποίο όμως είναι πολύ πιο αργό από αυτό που παρατηρείται στα φυσιολογικά κύτταρα. Η μειωμένη ταχύτητα μεταγραφής, απουσία λειτουργικής CSB πρωτεΐνης, οφείλεται πιθανά στην εκτεταμένη παρακώλυση των RNA πολυμερασών στα σημεία DNA βλαβών λόγω της ελαττωματικής επιδιόρθωσης τους σε αυτά τα κύτταρα. Ενώ η έναρξη της μεταγραφής φαίνεται ότι δεν επηρεάζεται, οι RNA πολυμεράσες επιμήκυνσης παραμένουν μόνιμα παγιδευμένες στα αρχικά τμήματα των γονιδίων και δεν επιτρέπουν την επανάκαμψη της επιμήκυνσης της μεταγραφής, με αποτέλεσμα την απώλεια ζωτικών μεταγράφων και την ενεργοποίηση μηχανισμών απόπτωσης των CS-B κυττάρων. Τα αποτελέσματα της 2ης ενότητας έχουν συμπεριληφθεί σε μια δημοσίευση η οποία είναι στο στάδιο υποβολής σε διεθνές επιστημονικό περιοδικό (Ntakou-Zamplara et al.)