Cell surface engineering of renal cell carcinoma with glycosylphosphatidylinositol-anchored TIMP-1 blocks TGF-beta 1 activation and reduces regulatory ID gene expression

Tissue inhibitor of metalloproteinase 1 (TIMP-1) controls matrix metalloproteinase activity through 1:1 stoichiometric binding. Human TIMP-1 fused to a glycosylphosphatidylinositol (GPI) anchor (TIMP-1-GPI) shifts the activity of TIMP-1 from the extracellular matrix to the cell surface. TIMP-1-GPI treated renal cell carcinoma cells show increased apoptosis and reduced proliferation. Transcriptomic profiling and regulatory pathway mapping were used to identify the potential mechanisms driving these effects. Significant changes in the DNA binding inhibitors, TGF-beta 1/SMAD and BMP pathways resulted from TIMP-1-GPI treatment. These events were linked to reduced TGF-beta 1 signaling mediated by inhibition of proteolytic processing of latent TGF-beta 1 by TIMP-1-GPI

Selektive Zelloberflächenmodulation von Nierenzellkarzinomen mit Glykosylphosphatidylinositol-verankertem TIMP-1 hemmt die TGF-β1-Aktivierung und senkt die Expression regulatorischer ID-Gene

Das zugunsten von Matrix Metalloproteinasen (MMP) verschobene Proteasen/Inhibitoren-Verhältnis begründet unter anderem die Malignität von Nierenzellkarzinomen. „Tissue Inhibitor of Metalloproteinases 1“ (TIMP-1), ein löslicher Gewebeinhibitor für Metalloproteinasen der extrazellulären Matrix, kontrolliert die Aktivität von MMP durch 1:1 stochiometrische Bindung. Durch Fusion von humanen TIMP-1 mit einem Glykosylphosphatidylinositol- (GPI-)Anker wird die TIMP-1-Aktivität von der extrazellulären Matrix auf die Zelloberfläche verschoben und eine lokale Applikation von definierten TIMP-1-Konzentrationen ermöglicht. Mit TIMP-1-GPI behandelte Nierenkarzinomzellen zeigten im Vergleich zu Vehikel und nativen TIMP-1-Kontrollgruppen signifikant erhöhte Apoptose- und reduzierte Proliferationsraten. Ziel der Arbeit ist mithilfe von transkriptomischem Profiling und Signaltransduktionsweg-Mapping verantwortliche Genregulationsmechanismen für TIMP-1-GPI-spezifische Effekte zu identifizieren. Mithilfe dieser Techniken zeigten wir, dass eine TIMP-1-GPI-Behandlung zu einer signifikanten Änderung der Regulation von „Inhibitor der DNA Bindung“ (ID), TGF-β/SMAD und BMP Signaltransduktionswege führte. Die unterdrückte ID-Proteinexpression ist auf die durch TIMP-1-GPI gehemmte proteolytische Aktivierung von pro-TGF-β1 und dadurch verursachte reduzierte TGF-β1-Signalaktivität zurückzuführen. Eine mögliche Erklärung für die Überlegenheit von TIMP-1-GPI gegenüber nativem TIMP-1 ist die fokale Konzentration auf der Zelloberfläche, die eine effektivere Hemmung von autosezernierten TGF-β1 ermöglicht. Diese besonderen Eigenschaften von TIMP-1-GPI könnten in der Therapie von Nierenzellkarzinomen als Adjuvanz bei der modernen chirurgischen Nierenteilresektion oder bei der Therapie mit Angiogenese-Hemmern zunutze gemacht werden, um mögliche Tumorrezidive zu verhindern

Selektive Zelloberflächenmodulation von Nierenzellkarzinomen mit Glykosylphosphatidylinositol-verankertem TIMP-1 hemmt die TGF-β1-Aktivierung und senkt die Expression regulatorischer ID-Gene

Das zugunsten von Matrix Metalloproteinasen (MMP) verschobene Proteasen/Inhibitoren-Verhältnis begründet unter anderem die Malignität von Nierenzellkarzinomen. „Tissue Inhibitor of Metalloproteinases 1“ (TIMP-1), ein löslicher Gewebeinhibitor für Metalloproteinasen der extrazellulären Matrix, kontrolliert die Aktivität von MMP durch 1:1 stochiometrische Bindung. Durch Fusion von humanen TIMP-1 mit einem Glykosylphosphatidylinositol- (GPI-)Anker wird die TIMP-1-Aktivität von der extrazellulären Matrix auf die Zelloberfläche verschoben und eine lokale Applikation von definierten TIMP-1-Konzentrationen ermöglicht. Mit TIMP-1-GPI behandelte Nierenkarzinomzellen zeigten im Vergleich zu Vehikel und nativen TIMP-1-Kontrollgruppen signifikant erhöhte Apoptose- und reduzierte Proliferationsraten. Ziel der Arbeit ist mithilfe von transkriptomischem Profiling und Signaltransduktionsweg-Mapping verantwortliche Genregulationsmechanismen für TIMP-1-GPI-spezifische Effekte zu identifizieren. Mithilfe dieser Techniken zeigten wir, dass eine TIMP-1-GPI-Behandlung zu einer signifikanten Änderung der Regulation von „Inhibitor der DNA Bindung“ (ID), TGF-β/SMAD und BMP Signaltransduktionswege führte. Die unterdrückte ID-Proteinexpression ist auf die durch TIMP-1-GPI gehemmte proteolytische Aktivierung von pro-TGF-β1 und dadurch verursachte reduzierte TGF-β1-Signalaktivität zurückzuführen. Eine mögliche Erklärung für die Überlegenheit von TIMP-1-GPI gegenüber nativem TIMP-1 ist die fokale Konzentration auf der Zelloberfläche, die eine effektivere Hemmung von autosezernierten TGF-β1 ermöglicht. Diese besonderen Eigenschaften von TIMP-1-GPI könnten in der Therapie von Nierenzellkarzinomen als Adjuvanz bei der modernen chirurgischen Nierenteilresektion oder bei der Therapie mit Angiogenese-Hemmern zunutze gemacht werden, um mögliche Tumorrezidive zu verhindern

Chemokinrezeptorexpression im kutanen T-Zell Lymphom und gezielte Beeinflussung der chemokinvermittelten Zellrekrutierung

Die Rekrutierung von Zellen ist ein komplexer, in mehreren Schritten ablaufender Mechanismus, der eine zentrale Bedeutung für zahlreiche biologische Prozesse, wie z.B. Entzündung, Transplantatabstoßung, Tumormetastasierung und Stammzell¬migration hat. Die Migration von Zellen aus dem Blutstrom oder einem Reservoir in ein Zielgewebe bzw. Zielorgan und umgekehrt wird durch zahlreiche spezifische und unspezifische Reize ausgelöst und orchestriert. Dies erfolgt zu einem großen Teil durch von Chemokinen regulierte Mechanismen. Chemokine sind chemotaktische Zytokine, welche an spezifische auf der Zelloberfläche exprimierte Chemokinrezeptoren (CCR) binden. Zellen mit entsprechenden Chemokinrezeptoren wandern entlang eines Chemokingradienten zum jeweiligen Ziel, z.B. einem Entzündungsherd oder einem Zielorgan. Erstes Ziel dieser Arbeit war die Analyse der Chemokinrezeptorexpression im kutanen T-Zell Lymphom (CTCL), einem Non-Hogkin-Lymphom mit primärer kutaner Manifestation. Der Nachweis von Chemokinrezeptoren erfolgte in vitro mit der Polymerasekettenreaktion (PCR), der Durchflusszytometrie und mit Migrations-versuchen. Der Chemokinrezeptornachweis auf Hautschnitten von CTCL-Patienten erfolgte mit der Immunhistochemie. Erstmals konnte der hautassoziierte Chemokinrezeptor CCR10 im Rahmen des CTCL nachgewiesen werden. Außerdem gelang der Nachweis der Chemokinrezeptoren CCR4, CCR7 und CXCR3 in Hautschnitten und Lymphknotenbiopsien. CXCR3 wurde erstmals im Sezary Syndrom, einer fortgeschrittenen und aggressiven CTCL-Unterform, beschrieben. In der Immunhistochemie wurde die stärkste CCR10-Expression in Sezary Syndrom-Hautschnitten festgestellt. In Biopsien von befallenen Lymphknoten zeigte sich ein auffälliges CCR10-Verteilungsmuster: CCR10-positive Zellen wurden im Lymphsinus nachgewiesen, drangen aber nur vereinzelt in den Lymphknoten ein. In peripheren, nicht-kutanen Lymphomen wurde CCR10 nicht nachgewiesen und ist somit vermutlich exklusiv auf dem primär kutanen CTCL exprimiert. Es ist davon auszugehen, dass CCR10 den Epidermotropismus vor allem in aggressiveren Stadien reguliert. Die Bedeutung von CCR10 für die lymphatische Metastasierung des CTCL ist noch nicht geklärt. CCR10 könnte in der Zukunft als Faktor für die klinische Einstufung des CTCL oder als Ziel für eine gezielte Tumortherapie dienen. Die gezielte Tumortherapie ist u.a. mit Chemokinantagonisten möglich. Sie erlauben die gezielte Beeinflussung der chemokingesteuerten Rekrutierung von Leukozyten, Stammzellen oder Tumorzellen. Deshalb wurde ein membranbindender Antagonist des Chemokins CCL5, als potentielles Agens für die lokale Therapie von Tumoren oder von Transplantatabstoßungen, generiert. Das Chemokin CCL5 und seine Rezeptoren spielen in der akuten Transplantatabstoßung und in der Tumorprogression, z.B. im Mammakarzinom, eine zentrale Rolle. Der CCL5-Antagonist Met-RANTES inhibiert in Transplantatabstoßungsmodellen die Rekrutierung von Leukozyten. Der akute Entzündungsprozess und der daraus resultierende chronische Gefäßschäden werden so vermindert. Auch in einem Tumormodell ist ein Effekt auf die lokale Tumorprogression wahrscheinlich. Der in dieser Arbeit hergestellte CCL5-Antagonist Met-RANTES(Dimer)-GPI soll eine lokale Therapie ohne systemische Nebenwirkungen ermöglichen. Durch die erstmals beschriebene Bindung eines Chemokins oder Chemokinderivats an einen Glykosylinositolphosphatidyl (GPI)-Anker soll der Antagonist effektiv in die Zellmembranen von Endothelzellen inkorporiert werden, länger auf dem Endothel verbleiben und die benötigte Proteinmenge vermindern. Zunächst wurde durch die Erweiterung des signalgebenden N-Terminus von CCL5 der CCL5-Antagonist Met-RANTES generiert. Ein Aminosäureaustausch erzeugte ein dimerisierendes Molekül, welches einfacher als die zur Polymerisierung neigende Wildform zu isolieren war. Das Protein wurde mit der PCR mit einem GPI-Anker fusioniert und in Chinese Hamster Ovary (CHO)-Zellen subkloniert. Met-RANTES(Dimer)-GPI wurde erfolgreich aus den CHO-Zellen isoliert und mit der Säulenchromatographie gereinigt. In in vitro-Versuchen wurde Met-RANTES(Dimer)-GPI effektiv in die Oberfläche von humanen Endothelzellen reinkorporiert und hemmte die transendotheliale Migration von Monozyten, welche bei der Transplantat¬abstoßung und bei der Tumorprogression eine wichtige Rolle spielen. Mit Met-RANTES(Dimer)-GPI präperfundierte Transplantate zeigen möglicherweise einen geringeren vaskulären Schaden bei der akuten Transplantatabstoßungsreaktion. Im Tumormodell soll eine Hemmung der Tumorinfiltration durch Monozyten, welche eine beschleunigte Tumorprogression verursachen, erreicht werden. Im Vergleich zu nicht GPI-gebundenen CCL5-Antagonisten würde eine lokale fokussierte Therapie ermöglicht und eine eventuell geringere zu applizierende Proteinmenge bei längerer Verweildauer erzielt. Die Ergebnisse dieser Arbeit erlauben zunächst einen genaueren Einblick in die Pathogenese des CTCL. Der Chemokinrezeptor CCR7 wird vor allem von fortgeschrittenen Formen mit lymphatischer Infiltration exprimiert. CCR10 wird erstmals im Zusammenhang mit dem CTCL beschrieben und vor allem von fortgeschrittenen Unterformen exprimiert. Desweiteren wurde ein membranbindender Chemokinantagonist hergestellt. Erstmals wird die Kombination eines Chemokins oder Chemokinderivats mit einem GPI-Anker beschrieben. Der Antagonist erlaubt eine hohe lokale Applikation ohne systemische Zirkulation des Agens. Mögliche Einsatzgebiete sind die gezielte Tumortherapie oder die Behandlung der Transplantatabstoßung

Recombinant GPI-anchored TIMP-1 stimulates growth and migration of peritoneal mesothelial cells.

Mesothelial cells are critical in the pathogenesis of post-surgical intraabdominal adhesions as well as in the deterioration of the peritoneal membrane associated with long-term peritoneal dialysis. Mesothelial denudation is a pathophysiolocigally important finding in these processes. Matrix metalloproteinase (MMP) biology underlies aspects of mesothelial homeostasis as well as wound repair. The endogenous tissue inhibitors of metalloproteinases (TIMPs) moderate MMP activity. METHODS AND FINDING: By modifying human TIMP-1 through the addition of a glycosylphosphatidylinositol (GPI) anchor, a recombinant protein was generated that efficiently focuses TIMP-1 on the cell surface. Treatment of primary mesothelial cells with TIMP-1-GPI facilitates their mobilization and migration leading to a dramatic increase in the rate of wound experimental closure. Mesothelial cells treated with TIMP-1-GPI showed a dose dependent increase in cell proliferation, reduced secretion of MMP-2, MMP-9, TNF-α and urokinase-type plasminogen activator (uPA), but increased tissue plasminogen activator (t-PA). Treatment resulted in reduced expression and processing of latent TGF-β1. TIMP-1-GPI stimulated rapid and efficient in vitro wound closure. The agent enhanced mesothelial cell proliferation and migration and was bioactive in the nanogram range. The application of TIMP-1-GPI may represent a new approach for limiting or repairing damaged mesothelium

Feasibility of low-dose digital pulsed video-fluoroscopic swallow exams (VFSE): effects on radiation dose and image quality

Background: Fluoroscopy is a frequently used examination in clinical routine without appropriate research evaluation latest hardware and software equipment. Purpose: To evaluate the feasibility of low-dose pulsed video-fluoroscopic swallowing exams (pVFSE) to reduce dose exposure in patients with swallowing disorders compared to high-resolution radiograph examinations (hrVFSE) serving as standard of reference. Material and Methods: A phantom study (Alderson-Rando Phantom, 60 thermoluminescent dosimeters [TLD]) was performed for dose measurements. Acquisition parameters were as follows: (i) pVFSE: 76.7 kV, 57 mA, 0.9 Cu mm, pulse rate/s 30;(ii) hrVFSE: 68.0 kV, 362 mA, 0.2 Cu mm, pictures 30/s. The dose area product (DAP) indicated by the detector system and the radiation dose derived from the TLD measurements were analyzed. In a patient study, image quality was assessed qualitatively (5-point Likert scale, 5 = hrVFSE;two independent readers) and quantitatively (SNR) in 35 patients who subsequently underwent contrast-enhanced pVFSE and hrVFSE. Results: Phantom measurements showed a dose reduction per picture of factor 25 for pVFSE versus hrVFSE images (0.0025 mGy versus 0.062 mGy). The DAP (mu Gym 2) was 28.0 versus 810.5 (pVFSE versus hrVFSE) for an average examination time of 30 s. Direct and scattered organ doses were significantly lower for pVFSE as compared to hrVFSE (P< 0.05). Image quality was rated 3.9 +/- 0.5 for pVFSE versus the hrVFSE standard;depiction of the contrast agent 4.8 +/- 0.3;noise 3.6 +/- 0.5 (P< 0.05);SNR calculations revealed a relative decreased of 43.9% for pVFSE as compared to hrVFSE. Conclusion: Pulsed VFSE is feasible, providing diagnostic image quality at a significant dose reduction as compared to hrVFSE

Submillisievert Computed Tomography of the Chest Using Model-Based Iterative Algorithm: Optimization of Tube Voltage With Regard to Patient Size

Objective: The aim of this study was to define optimal tube potential for soft tissue and vessel visualization in dose-reduced chest CT protocols using model-based iterative algorithm in average and overweight patients. Methods: Thirty-six patients receiving chest CTaccording to 3 protocols (120 kVp/noise index [NI], 60;100 kVp/NI, 65;80 kVp/NI, 70) were included in this prospective study, approved by the ethics committee. Patients' physical parameters and dose descriptors were recorded. Images were reconstructed with model-based algorithm. Two radiologists evaluated image quality and lesion conspicuity;the protocols were intraindividually compared with preceding control CT reconstructed with statistical algorithm (120 kVp/NI, 20). Mean and standard deviation of attenuation of the muscle and fat tissues and signal-to-noise ratio of the aorta were measured. Results: Diagnostic images (lesion conspicuity, 95%-100%) were acquired in average and overweight patients at 1.34, 1.02, and 1.08 mGy and at 3.41, 3.20, and 2.88 mGy at 120, 100, and 80 kVp, respectively. Data are given as CT dose index volume values. Conclusions: Model-based algorithm allows for submillisievert chest CT in average patients;the use of 100 kVp is recommended

Imaging characteristics of intravascular spherical contrast agents for grating-based x-ray dark-field imaging - effects of concentrations, spherical sizes and applied voltage

This study investigates the x-ray scattering characteristics of microsphere particles in x-ray-grating-based interferometric imaging at different concentrations, bubble sizes and tube voltages (kV). Attenuation (ATI), dark-field (DFI) and phase-contrast (PCI) images were acquired. Signal-to-noise (SNR) and contrast-to-noise ratios with water (CNRw) and air as reference (CNRa) were determined. In all modalities, a linear relationship between SNR and microbubbles concentration, respectively, microsphere size was found. A significant gain of SNR was found when varying kV. SNR was significantly higher in DFI and PCI than ATI. The highest gain of SNR was shown at 60kV for all media in ATI and DFI, at 80kV for PCI. SNR for all media was significantly higher compared to air and was slightly lower compared to water. A linear relationship was found between CNRa, CNRw, concentration and size. With increasing concentration and decreasing size, CNRa and CNRw increased in DFI, but decreased in PCI. Best CNRa and CNRw was found at specific combination of kV and concentration/size. Highest average CNRa and CNRw was found for microspheres in ATI and PCI, for microbubbles in DFI. Microspheres are a promising contrast-media for grating-based-interferometry, if kV, microsphere size and concentration are appropriately combined

A complex pattern of chemokine receptor expression is seen in osteosarcoma

<p>Abstract</p> <p>Background</p> <p>Osteosarcoma is the most frequent bone tumor in childhood and adolescence. Patients with primary metastatic disease have a poor prognosis. It is therefore important to better characterize the biology of this tumor to define new prognostic markers or therapeutic targets for tailored therapy. Chemokines and their receptors have been shown to be involved in the development and progression of malignant tumors. They are thought to be active participants in the biology of osteosarcoma. The function of specific chemokines and their receptors is strongly associated with the biological context and microenvironment of their expression. In this report we characterized the expression of a series of chemokine receptors in the complex environment that defines osteosarcoma.</p> <p>Methods</p> <p>The overall level of chemokine receptor mRNA expression was determined using TaqMan RT-PCR of microdissected archival patient biopsy samples. Expression was then verified at the protein level by immunohistochemistry using a series of receptor specific antibody reagents to elucidate the cellular association of expression.</p> <p>Results</p> <p>Expression at the RNA level was found for most of the tested receptors. CCR1 expression was found on infiltrating mononuclear and polynuclear giant cells in the tumor. Cells associated with the lining of intratumoral vessels were shown to express CCR4. Infiltrating mononuclear cells and tumor cells both showed expression of the receptor CCR5, while CCR7 was predominantly expressed by the mononuclear infiltrate. CCR10 was only very rarely detected in few scattered infiltrating cells.</p> <p>Conclusion</p> <p>Our data elucidate for the first time the cellular context of chemokine receptor expression in osteosarcoma. This is an important issue for better understanding potential chemokine/chemokine receptor function in the complex biologic processes that underlie the development and progression of osteosarcoma. Our data support the suggested involvement of chemokines and their receptors in diverse aspects of the biology of osteosarcoma, but also contradict aspects of previous reports describing the expression of these receptors in this tumor.</p

Multiparametric Functional MRI: A Tool to Uncover Subtle Changes following Allogeneic Renal Transplantation

Purpose To investigate multiparametric functional MRI to characterize acute rejection in a murine allogeneic renal transplant model and evaluate the effect of novel therapeutics. Material and Methods We performed allogeneic and syngeneic orthotopic transplantations (Balb/c to C57Bl/6 and C57Bl/6 to C57Bl/6). Allogeneic Groups (n = 5) were either treated with the anti-CCL2-Spiegelmer (mNOX-E36) in monotherapy or in combination with low doses of Ciclosporin-A (10mg/kgBW/d) for 10 days. Controls received equivalent doses of a non-functional spiegelmer (revmNOX-E36) or low dose Ciclosporin-A. Diffusion-weighted (DWI) and Dynamic-contrast-enhanced (DCE-) MRI-scans were performed using a clinical 3T-scanner. DWI analysis (b-values from 0-800 s/mm(2)) was performed mono-and biexponentially, while DCE-MRI was assessed with deconvolution analysis. Therapy effects were assessed ex vivo with histopathology, immunohistochemistry and RT-PCR. Statistical analysis was performed with unpaired t-tests and Spearman As correlation coefficient. Results DWI showed a significant diffusion restriction in allogeneic compared to syngeneic transplants (ADC: 0.63 +/- 0.08 vs. 1.29 +/- 0.12 mm(2)/s*10(3)) with decreasing diffusion restriction under therapy. DCE-MRI showed restored organ perfusion under Ciclosporin A alone and combination therapy (Plasma Flow: 43.43 +/- 12.49;38.75 +/- 7.53ml/100ml/min) compared to syngeneic controls (51.03 +/- 12.49ml/100ml/min). Ex vivo analysis showed reduced monocytic infiltrates, attenuated levels of inflammatory cytokines under mNOX-E36 monotherapy with an additive effect of low dose Ciclosporin A. There was a significant (p<0.05) negative correlation between ADC and interstitial inflammation (r = -0.73) or macrophage infiltration (r = -0.81) and between organ perfusion and intimal arteritis (r = -0.63). Conclusion Multiparametric functional MRI is suited to detect renal allograft rejection in an experimental murine model and allows to characterize effects of immunosuppressive therapy alleviating acute rejection processes in allogeneic transplantation