Metabolomic Profiling of Extracellular Vesicles and Alternative Normalization Methods Reveal Enriched Metabolites and Strategies to Study Prostate Cancer-Related Changes

Body fluids are a rich source of extracellular vesicles (EVs), which carry cargo derived from the secreting cells. So far, biomarkers for pathological conditions have been mainly searched from their protein, (mi) RNA, DNA and lipid cargo. Here, we explored the small molecule metabolites from urinary and platelet EVs relative to their matched source samples. As a proof-of-concept study of intra-EV metabolites, we compared alternative normalization methods to profile urinary EVs from prostate cancer patients before and after prostatectomy and from healthy controls. Methods: We employed targeted ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry to profile over 100 metabolites in the isolated EVs, original urine samples and platelets. We determined the enrichment of the metabolites in the EVs and analyzed their subcellular origin, pathways and relevant enzymes or transporters through data base searches. EV-and urine-derived factors and ratios between metabolites were tested for normalization of the metabolomics data. Results: Approximately 1 x 10(10) EVs were sufficient for detection of metabolite profiles from EVs. The profiles of the urinary and platelet EVs overlapped with each other and with those of the source materials, but they also contained unique metabolites. The EVs enriched a selection of cytosolic metabolites including members from the nucleotide and spermidine pathways, which linked to a number of EV-resident enzymes or transporters. Analysis of the urinary EVs from the patients indicated that the levels of glucuronate, D-ribose 5-phosphate and isobutyryl-L-carnitine were 2-26-fold lower in all pre-prostatectomy samples compared to the healthy control and post-prostatectomy samples (p <0.05). These changes were only detected from EVs by normalization to EV-derived factors or with metabolite ratios, and not from the original urine samples. Conclusions: Our results suggest that metabolite analysis of EVs from different samples is feasible using a high-throughput platform and relatively small amount of sample material. With the knowledge about the specific enrichment of metabolites and normalization methods, EV metabolomics could be used to gain novel biomarker data not revealed by the analysis of the original EV source materials.Peer reviewe

Lyophilized disaccharides : the effect of water during storage

Nearly one fourth of new medicinal molecules are biopharmaceutical (protein, antibody or nucleic acid derivative) based. However, the administration of these compounds is not always that straightforward due to the fragile nature of aforementioned domains in GI-tract. In addition, these molecules often exhibit poor bioavailability when administered orally. As a result, parenteral administration is commonly preferred. In addition, shelf-life of these molecules in aqueous environments is poor, unless stored in low temperatures. Another approach is to bring these molecules to anhydrous form via lyophilization resulting in enhanced stability during storage. Proteins cannot most commonly be freeze dried by themselves so some kind of excipients are nearly always necessary. Disaccharides are commonly utilized excipients in freeze-dried formulations since they provide a rigid glassy matrix to maintain the native conformation of the protein domain. They also act as "sink"-agents, which basically mean that they can absorb some moisture from the environment and still help to protect the API itself to retain its activity and therefore offer a way to robust formulation. The aim of the present study was to investigate how four amorphous disaccharides (cellobiose, melibiose, sucrose and trehalose) behave when they are brought to different relative humidity levels. At first, solutions of each disaccharide were prepared, filled into scintillation vials and freeze dried. Initial information on how the moisture induced transformations take place, the lyophilized amorphous disaccharide cakes were placed in vacuum desiccators containing different relative humidity levels for defined period, after which selected analyzing methods were utilized to further examine the occurred transformations. Affinity to crystallization, water sorption of the disaccharides, the effect of moisture on glass transition and crystallization temperature were studied. In addition FT-IR microscopy was utilized to map the moisture distribution on a piece of lyophilized cake. Observations made during the experiments backed up the data mentioned in a previous study: melibiose and trehalose were shown to be superior over sucrose and cellobiose what comes to the ability to withstand elevated humidity and temperature, and to avoid crystallization with pharmaceutically relevant moisture contents. The difference was made evident with every utilized analyzing method. In addition, melibiose showed interesting anomalies during DVS runs, which were absent with other amorphous disaccharides. Particularly fascinating was the observation made with polarized light microscope, which revealed a possible small-scale crystallization that cannot be observed with XRPD. As a result, a suggestion can safely be made that a robust formulation is most likely obtained by utilizing either melibiose or trehalose as a stabilizing agent for biopharmaceutical freeze-dried formulations. On the other hand, more experiments should be conducted to obtain more accurate information on why these disaccharides have better tolerance for elevating humidities than others.Lähes joka neljäs uusi markkinoille tuleva lääkeainemolekyyli on biologista alkuperää kuten proteiineja, vasta-aineita tai nukleiinihappojohdannaisia. Näiden lääkeaineiden herkästä rakenteesta johtuen annostelu perinteisesti peroraalisesti ei ole aina mahdollista. Labiilin rakenteen lisäksi kyseiset molekyylit eivät imeydy hyvin ruoansulatuskanavasta, jolloin biologinen hyötyosuus jää heikoksi. Edellä mainituista syistä parenteraalinen annostelu on tyypillinen tapa annostella näitä lääkkeitä. Lisäksi ne myös säilyvät huonosti vesiliuoksissa ja vaativat alhaisen säilytyslämpötilan. Yksi tapa parantaa näiden lääkeainemolekyylien stabiiliutta säilytyksen aikana, on kylmäkuivata ne lähes vedettömään kiinteään olomuotoon. Ne eivät kuitenkaan sovellu sellaisenaan kylmäkuivattaviksi, vaan lähes aina tarvitaan jotain apuainetta mahdollistamaan kylmäkuivaus. Disakkaridit ovat laajasti käytettyjä apuaineita kylmäkuivauksessa, koska ne kykenevät säilyttämään herkän biologista alkuperää olevan lääkeainemolekyylin natiivin rakenteen ja täten myös sen biologisen aktiivisuuden sekä itse prosessin että säilytyksen aikana. Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli tutkia kuinka neljä amorfista kylmäkuivattua disakkaridia (sellobioosi, melibioosi, sakkaroosi ja trehaloosi) käyttäytyvät eri kosteuksissa säilytyksen aikana. Työn aluksi disakkaredeista valmistettiin kylmäkuivattavat vesiliuokset, pipetoitiin liuokset kylmäkuivausvialeihin ja kylmäkuivattiin vialit. Aluksi tutkittavat disakkaridit sijoitettiin suolaliuoksellisiin eksikaattoreihin, jotta voitiin seurata minkälaisella aikajänteellä eri kosteudet saavat aikaan tapahtumia tutkituissa disakkarideissa. Kokeiden aikana tutkittiin kosteuden vaikutusta kiteytymistaipumukseen, disakkaridien veden sorptiota ja kosteuden vaikutusta lasisiirtymä- ja kiteytymislämpötilaan. Lisäksi hyödynnettiin FT-IR mikroskooppia, jolla kyettiin kartoittamaan vesimolekyylien jakautumista kylmäkuivatun disakkaridikakun pinnalla. Kuten aikaisemmassa tutkimuksessakin havaittiin, melibioosi ja trehaloosi osoittautuivat kokeiden aikana paremmin sietämään kohoavia lämpötiloja ja kosteuksia kuin sellobioosi ja sakkaroosi. Melibioosi ja trehaloosi osoittivat myös kykyä sietää farmaseuttisesti relevantteja kosteuspitoisuuksia ilman, että amorfinen faasi olisi kiteytynyt tämän kosteuden vaikutuksesta säilytyksen aikana. Tämä amorfisten disakkaridien välinen stabiilisuusero voitiin osoittaa kaikilla käytetyillä analyysimenetelmillä. Melibioosi käyttäytyi erityisen mielenkiintoisesti kokeiden aikana: mahdollinen pienen mittakaavan kiteytyminen säilytyksen aikana, mikä näkyi polarisaatiomikroskoopilla, mutta mitä ei havaittu XRPD:llä. Myös käyttäytyminen DVS-ajojen aikana poikkesi melibioosin ja muiden disakkaridien välillä. Turvallisin mielin voidaan saatujen tulosten perusteella lausua, että valitsemalla stabilointiaineeksi joko melibioosi tai trehaloosi on todennäköistä saada hyvän säilyvyyden omaava robusti formulaatio. Toisaalta lisätutkimuksia vielä vaaditaan, jotta päästään kiinni perimmäisiin syihin, miksi juuri nämä kaksi disakkaridia kykenevät paremmin sietämään kohoavia kosteusolosuhteita kuin sellobioosi ja sakkaroosi

Remote and Autonomous Ships - The Next Steps

The AAWA-initiative whitepaper explores the development of remote and autonomous ships from technological, legal, safety & security, and business perspectives.</p