Study of the biological function of SR protein kinases

The elucidation of the biological function(s) of SR protein kinases (SRPKs) that specifically modify SR or RS dipeptide motifs was the main goal of this doctoral dissertation. We have previously shown that SAFB1 interacts with the extended NH2- terminal domain of SRPK1a, an alternatively spliced form of SRPK1 and contains an insertion of 171 amino acids at its NH2-terminal domain. Using the same yeast two hybrid approach we observed a weaker interaction of the same domain of SRPK1a with p53. Following these observations, we noticed that a fraction of nuclear p53 bound to and co-localized with SAFB1. In agreement with previous studies, the nuclear matrix-associated fraction of p53 that co-localized with SAFB1 dramatically increased upon treatment of cells with genotoxic agents such as mithramycin or 5- fluorouracil. Binding of p53 to SAFB1 was shown to be functionally significant, since SAFB1 suppressed p53-mediated reporter gene expression in p53-null cells (K562) doubly transfected with p53 and SAFB1. In view of the fact that neither SAFB1 nor p53 are phosphorylated by SRPKs, we discuss the potential role of SRPK1a in regulating the assembly of SAFB1-based regulatory complexes, associated with the nuclear matrix. In a following step, we studied the effect of phosphorylation of the RS domain of LBR, on its structure and on its interaction with histone H3 and heterochromatic protein HP1. Association with RNA molecules or phosphorylation of the serine residues within the RS domain, by SRPK1, renders the NH2-terminal part of LBR soluble. Phosphorylation was found to promote binding of histone H3, whereas we did not observe any effect on HP1 association. Trying to understand the structural changes due to the phosphorylation of the RS domain we proceeded with molecular dynamics simulations. In this respect, the RS domain of human LBR, containing four subsequent RS dipeptides (RSRSRSRS), in ideal extended conformation, was initially subjected to energy minimization, followed by molecular dynamics simulations. The same approach was followed for the phosphorylated RS domain, in which all serines within the RS domain were considered to be phosphorylated. The results showed that phosphorylation causes a dramatic change in the configuration of the RS domain. More specifically the non-phosphorylated RS domain exhibits an a-helical structure which remains constant upon 200 ns simulations, whereas the phosphorylated RS domain exhibits an array of extended disordered conformations. As a-helices participate in protein-protein interactions and self-associations this may explain the self-precipitation of the NH₂-terminal parts of LBR in solution. Finally, using in vitro binding assays we demonstrated that phosphorylated protamine 1 binds specifically to the RS region of LBR. Immunofluorescence microscopy studies on several isolated spermiogenic cells during the elongation process clearly showed that protamine 1 and LBR exhibit the same peripheral, polarized distribution in the nucleus of elongating spermatids. In an attempt to determine more specifically which serine residue, within the RS domain of protamine 1, mediates its association with LBR, we constructed a set of protamine mutants, in which Ser⁹, Ser¹¹ and Ser¹³ were changed to Ala, and expressed them as GFP-fusion proteins in HeLa cells. Mutation of Ser⁹ to Ala completely abolished the interaction of protamine 1 with the NH2-terminal part of LBR, whereas mutation of Ser¹¹ and Ser¹³ to Ala had practically no effect on the protamine/LBR interaction. Furthermore, fluorescence microscopy studies showed that a significant fraction of Prm1(9A)-GFP mutant remained in the cytoplasm, whereas the localization of Prm1-GFP, Prm1(11A)- GFP and Prm1(13A)-GFP was exclusively nuclear. This implies that the interaction of protamine 1 with the NH₂-terminal part of LBR probably plays a significant role in the nuclear localization of protamine1.Η μελέτη του βιολογικού ρόλου των SRPKs αποτέλεσε το θέμα αυτής της διδακτορικής διατριβής. Η εργασία μας κινήθηκε σε τρεις άξονες: • Ο πρώτος άξονας αφορούσε τις πιθανές αλληλεπιδράσεις της SRPK1a, η οποία αποτελεί προϊόν εναλλακτικού ματίσματος του ίδιου γονιδίου με την SRPK1 και περιέχει σε σχέση με την SRPK1 μία πρόσθετη ακολουθία 171 αμινοξέων στο Ν-τελικό της άκρο. Χρησιμοποιώντας το σύστημα των δύο υβριδίων βρήκαμε ότι η SRPK1a βρίσκεται σε σύμπλοκο με τις πρωτεΐνες p53 και SAFB1. Καμία από τις δύο αυτές πρωτεΐνες που βρέθηκαν να αλληλεπιδρούν με την SRPK1a δεν αποτελεί υπόστρωμα της κινάσης αφού και οι δύο στερούνται RS αλληλουχιών. Έτσι, σε μια πρώτη προσέγγιση αποφασίσαμε να ελέγξουμε αν υπάρχει κάποιου είδους συσχέτιση ανάμεσα στις πρωτεΐνες p53 και SAFB1. Η πρωτεΐνη SAFB1 έχει βρεθεί να είναι συνδεδεμένη στο μεγαλύτερο ποσοστό της με την πυρηνική μήτρα. Αντίθετα ένα σχετικά μικρό ποσοστό της πρωτεΐνης p53 φαίνεται να εντοπίζεται στον πυρήνα σε control HepG2 κύτταρα. Προσθήκη όμως στα κύτταρα κυτταροστατικών φαρμάκων, όπως μιθραμυκίνη και 5’ φθοροουρακίλη, έχει ως αποτέλεσμα την σημαντική αύξηση των επιπέδων του p53. Στη περίπτωση των κυττάρων που έχουν κατεργαστεί με μιθραμυκίνη ή 5’ φθοροουρακίλη το μεγαλύτερο ποσοστό της πρωτεΐνης p53 εντοπίζεται στον πυρήνα και μάλιστα ένα σημαντικό μέρος από την πυρηνική p53 βρίσκεται ενωμένο με την πυρηνική μήτρα. Επεκτείνοντας αυτές τις παρατηρήσεις, βρήκαμε ότι η καρβοξυτελική περιοχή της πρωτεΐνης SAFB1 αλληλεπιδρά με την πρωτεΐνη p53, ενώ με δοκιμασίες έμμεσου ανοσοφθορισμού παρατηρήθηκε σημαντική συνεντόπιση των p53 και SAFB1 σε HepG2 κύτταρα που είχαν κατεργαστεί με 5-φθοροουρακίλη ή μιθραμυκίνη. Γνωρίζοντας ότι μια από τις βασικές λειτουργίες της πρωτεΐνης p53 είναι η δραστικότητά της ως μεταγραφικός παράγοντας, ένα επόμενο ερώτημα που θελήσαμε να απαντήσουμε είναι εάν ο SAFB1 έχει κάποια επίδραση στην μεταγραφική ικανότητα του p53. Συνέκφραση p53 και SAFB1 στα Κ562 κύτταρα είχε ως αποτέλεσμα μείωση στα επίπεδα μεταγραφής του γονιδίου αναφοράς γεγονός που υποδηλώνει τη συμμετοχή της πρωτεΐνης SAFB1 στη ρύθμιση της μεταγραφικής ενεργότητας του p53. Τέλος στη διατριβή συζητείται ο πιθανός ρόλος της SRPK1a στη ρύθμιση της συγκρότησης ρυθμιστικών συμπλόκων που συνδέονται με την πυρηνική μήτρα. • Ο δεύτερος άξονας αφορούσε τη μελέτη της φωσφορυλίωσης του υποδοχέα της λαμίνης Β (LBR) από την SRPK1. Βρέθηκε ότι η φωσφορυλίωση του αμινοτελικού άκρου του LBR από την SRPK1 έχει το ίδιο αποτέλεσμα με αυτό που έχει η αλληλεπίδρασή του με μόρια RNA, αυξάνει δηλαδή την διαλυτότητά του. Το φωσφορυλιωμένο αμινοτελικό άκρο αλληλεπιδρά με την ιστόνη Η3, ενώ αντίθετα η φωσφορυλίωση δεν έχει καμμία επίδραση στην αλληλεπίδρασή του με την ετεροχρωματινική πρωτεΐνη HP1. Από τη μελέτη μας επίσης προέκυψε ένα πολύ ενδιαφέρον συμπέρασμα το οποίο πιθανά να δίνει και μια σφαιρική ερμηνεία για τον ρόλο της φωσφορυλίωσης ενός τόσο μεγάλου αριθμού ετερογενών πρωτεϊνών με διαφορετικές λειτουργικότητες και κυτταρική εντόπιση. Συγκεκριμένα προέκυψε ότι η μη φωσφορυλιωμένη RS ακολουθία εμφανίζει διαμόρφωση α-έλικας, ή οποία μάλιστα παραμένει και σταθερή, ενώ αντίθετα η φωσφορυλίωση της RS ακολουθίας έχει ως αποτέλεσμα αυτή να λαμβάνει μια πληθώρα από τυχαίες αποδιαταγμένες διαμορφώσεις. Η δραματική αυτή αλλαγή στη διαμόρφωση πιθανά εξηγεί και την τάση δημιουργίας συσσωματωμάτων από τα μη φωσφορυλιωμένα αμινοτελικά άκρα. • Τέλος ο τρίτος άξονας αφορούσε τη φωσφορυλίωση της πρωταμίνης 1 από την SRPK1. Διαπιστώθηκε, με πειράματα συγκατακρήμνισης, ότι μόνο όταν η πρωταμίνη 1 είναι φωσφορυλιωμένη από την SRPK1 δεσμεύεται στην RS ακολουθία του LBR. Η αλληλεπίδραση αυτή επιβεβαιώνεται και με δοκιμασίες ανοσοφθορισμού σε τμήματα σπερματοφόρου σωληνίσκου ποντικού, όπου και διαπιστώθηκε ότι ο LBR και η πρωταμίνη 1, κατά την έναρξη της επιμήκυνσης των σπερματίδων, συνεντοπίζονται στην πυρηνική περιφέρεια. Μια σειρά από σημειακές μεταλλάξεις έδειξαν ότι η φωσφορυλίωση της σερίνης 9 παίζει καθοριστικό ρόλο στην αλληλεπίδραση της πρωταμίνης 1 με το αμινοτελικό άκρο του LBR. Σε συνέχεια αυτής της παρατήρησης, δείξαμε ότι η απουσία αλληλεπίδρασης του μεταλλάγματος Prm1(9A)-GFP με το αμινοτελικό άκρο του LBR είχε επίδραση στην υποκυτταρική του εντόπιση. Συγκεκριμένα, παρατηρήθηκε ότι ένα μέρος του μεταλλάγματος, μετά από υπερέκφρασή του σε HeLa κύτταρα παραμένει στο κυτταρόπλασμα. Πιθανά λοιπόν, σε κάποια έκταση, η αλληλεπίδραση της πρωταμίνης 1 με το αμινοτελικό άκρο του LBR να συνεισφέρει στην πυρηνική εντόπιση της πρωταμίνης

Substrate competition assays.

<p>(A) Phosphorylation of MBP (1.1 μM) and GST-LBRNt(62–92) (0.7 μM) by Akt1 (0.07 μM) in the presence of increasing concentrations of H2B (2.8, 5.6 and 5.6 μM). Upper panel, Coomassie blue staining; lower panel autoradiography. (B) Phosphorylation of H2B (1.4 μM) and GST-LBRNt(62–92) (0.7 μM) by Akt1 (0.07 μM) in the presence of increasing concentrations of R0 peptide (125, 250, 375 and 500 μM). Upper panel, Coomassie blue staining; lower panel autoradiography.</p

SRPK1 and Akt Protein Kinases Phosphorylate the RS Domain of Lamin B Receptor with Distinct Specificity: A Combined Biochemical and <i>In Silico</i> Approach

<div><p>Activated Akt has been previously implicated in acting on RS domain-containing proteins. However, it has been questioned whether its action is direct or it is mediated by co-existing SR kinase activity. To address this issue we studied in detail the phosphorylation of Lamin B Receptor (LBR) by Akt. Using synthetic peptides and a set of recombinant proteins expressing mutants of the LBR RS domain we now demonstrate that while all serines of the RS domain represent more or less equal phosphoacceptor sites for SRPK1, Ser80 and Ser82 are mainly targeted by Akt. 3D-modeling combined with molecular dynamics (MD) simulations show that amongst short, overlapping LBR RS-containing peptides complying with the minimum Akt recognition consensus sequence, only those bearing phosphosites either at Ser80 or Ser82 are able to fit into the active site of Akt, at least as effectively as its known substrate, GSK3-β. Combined our results provide evidence that Akt kinases directly phosphorylate an RS domain-containing protein and that both the residues N-terminal the phosphosite and at position +1 are essential for Akt specificity, with the latter substrate position being compatible with the arginine residue of RS-repeats.</p></div

Phosphorylation of LBRNt(62–92) and LBRNt(62–92)ΔRS by Akt1.

<p>(A) Amino acid sequence of LBRNt(62–92). The RS domain is underlined and the putative Akt sites (Ser80, Ser82 and Ser84) are marked with an asterisk. (B) Phosphorylation of GST-LBRNt(62–92) and GST-LBRNt(62–92)ΔRS by 0.07 <b>μ</b>M Akt1. The samples were analyzed by SDS-PAGE on 12% gels, stained with Coomassie Blue and autoradiographed.</p

Phosphorylation of LBRNt(62–92) by GST-SRPK1 and Akt1 in the presence of different synthetic peptides.

<p>(A) Amino acid sequences of the peptides used. The relative position of the peptides in LBRNt(62–92) is schematically indicated. 1.95 μM GST-LBRNt(62–92) were incubated with 0.19 μM GST-SRPK1 (B) or 0.07 μM recombinant Akt1 (C) or immunoprecipitated myristoylated HA-Akt1 and FLAG-Akt2 (D) in the presence of 500 μM of each peptide and 25 μM [γ- ³²P]ATP as described under “Materials and Methods”. Samples were subsequently analyzed by SDS-PAGE on a 15% gel and autoradiographed. In (B), (C) and (D) phosphorylation of GST-LBRNt(62–92) is shown in the upper panel and phosphorylation of the peptides is shown in the lower panel.</p

Distance between phosphosites and ATP γ-phosphate in the ternary complexes.

<p>Distance between phosphosites and ATP γ-phosphate in the ternary complexes.</p

Determination of the sites phosphorylated by SRPK1 and Akt1.

<p>Phosphorylation of GST-LBRNt(62–92), GST-LBRNt(62–92)S76G, GST-LBRNt(62–92)S78G, GST-LBRNt(62–92)S80A, GST-LBRNt(62–92)S82A και GST-LBRNt(62–92)S84A by 0.19 μM GST-SRPK1 (left panel) and 0.07 μM Akt1 (right panel). Only the relevant part of the autorad corresponding to the phosphorylated recombinant proteins is shown. Enzyme activity is expressed as a percent of the activity obtained with GST-LBRNt(62–92) which was set to 100 percent. Data represent the means ± SE of three independent experiments. On top of the figure we show a Coomassie Blue staining of the recombinant proteins (1.95 μM of each) used in the phosphorylation assays.</p

Backbone fluctuations of the simulated GSK3-β and LBR peptides bound to Akt2.

<p>Average RMSF values (see “<a href="http://www.plosone.org/article/info:doi/10.1371/journal.pone.0154198#sec002" target="_blank">Materials & Methods</a>”) obtained from the corresponding sets of MD simulations of the (left) binary and (right) ternary complexes simulated in this study. Bar lines represent corresponding standard deviations from the mean value within each MD simulation set. Substrate peptide positions are numbered according to the Akt consensus motif (<a href="http://www.plosone.org/article/info:doi/10.1371/journal.pone.0154198#pone.0154198.g005" target="_blank">Fig 5A</a>).</p

Atomic details of the interactions of LBR peptides with Akt2 in the simulated ternary complexes.

<p>Details of the interactions of the GSK3-β peptide with Akt2 in the template crystal structure and in the corresponding final 3D-model produced in this study are also shown. The bound peptides are depicted as stick models and are colored according to their atomic B-factors (see “<a href="http://www.plosone.org/article/info:doi/10.1371/journal.pone.0154198#sec002" target="_blank">Materials & Methods</a>”): from blue to red for low to high B-factor values, respectively. Critical residues are labeled. Peptide positions are numbered according to the Akt consensus motif. The ANP and ATP molecules are depicted as balls-and-sticks. Magnesium (manganese in the crystal structure) atoms are shown as spheres, in magenta. H-bond interactions are depicted as broken lines. This figure was rendered using PyMOL.</p

3D-modeling of LBR peptides in complex with Akt2.

<p>(A) Sequence alignment of overlapping LBR peptides used for 3D-modeling of Akt2/LBR-peptide complexes and of the GSK3-β peptide. The consensus sequence of the Akt recognition motif is also shown. h stands for large hydrophobic aminoacids. Potential phosphoacceptor serine residues are indicated by an arrow. (B) The known crystal structure of the GSK3-β peptide (in tube) bound to the kinase domain of human Akt2 (in ribbon), used as the modeling template (1O6K) [<a href="http://www.plosone.org/article/info:doi/10.1371/journal.pone.0154198#pone.0154198.ref026" target="_blank">26</a>]. Substrate peptide positions are numbered according to the Akt consensus shown in A. The phosphoacceptor site is indicated by an orange sphere. (C) Results of multiple, independent MD simulations (<a href="http://www.plosone.org/article/info:doi/10.1371/journal.pone.0154198#pone.0154198.s005" target="_blank">S1 Table</a>) of the LBR peptides shown in A and of the GSK3-β peptide in complex with human Akt2 (as in B). Only the multiple MD models (and the corresponding initial conformations; in yellow) of the bound peptides are shown for clarity. The phosphoacceptor serines are labeled. Molecular model illustrations were rendered using VMD [<a href="http://www.plosone.org/article/info:doi/10.1371/journal.pone.0154198#pone.0154198.ref037" target="_blank">37</a>].</p