Σχεδιασμός, σύνθεση και αξιολόγηση της κυτταροτοξικής δράσης νέων 3,7-διαρυλοϋποκατεστημένων 6-αζαϊνδολίων

Σημαντική πρόοδος στην αντιμετώπιση του καρκίνου τα τελευταία είκοσι χρόνια έχει γίνει με τη χρήση νέων θεραπευτικών παραγόντων, οι οποίοι δρουν με πιο στοχευμένο τρόπο σε σχέση με τα προϋπάρχοντα συμβατικά χημειοθεραπευτικά φάρμακα. Οι νέες αυτές στοχευμένες θεραπείες βασίζονται κυρίως στη χρήση ενώσεων που μπορεί να δράσουν ως αναστολείς πρωτεϊνικών κινασών ή στη χρήση μονοκλωνικών αντισωμάτων, και εμφανίζουν μεγάλη αποτελεσματικότητα με περιορισμένες ανεπιθύμητες ενέργειες. Οι αναστολείς πρωτεϊνικών κινασών είναι ενώσεις που μπορούν να ανταγωνίζονται το ATP στη θέση πρόσδεσής του στο ενεργό κέντρο κινασών οι οποίες υπερεκφράζονται σε αρκετά καρκινικά κύτταρα, αναστέλλοντας έτσι την ενεργοποίηση σηματοδοτικών μονοπατιών που σχετίζονται με την ανάπτυξη αυτών καρκινικών κυττάρων. Τα πουρινικά παράγωγα αποτελούν σημαντική κατηγορία των αναστολέων αυτών, λόγω της δομικής τους ομοιότητας με την αδενίνη του ATP, και αρκετά από αυτά έχουν ήδη λάβει έγκριση ως αντικαρκινικά φάρμακα. Στο πλαίσιο της ενασχόλησης της ερευνητικής μας ομάδας με την εύρεση νέων ενώσεων με πιθανή κυτταροτοξική δράση, τα τελευταία χρόνια στο εργαστήριο μας έχει συντεθεί ένας μεγάλος αριθμός ετεροκυκλικών ενώσεων που φέρουν ως βασικό σκελετό ένα δικυκλικό σύστημα, που φέρει δύο ή περισσότερα άτομα αζώτου, και τα οποία επέδειξαν ενδιαφέρουσα κυτταροτοξική δράση ή/και ανασταλτική δράση έναντι πρωτεϊνικών κινασών, με τιμές IC50 που βρίσκονται σε μονοψήφιες τιμές μΜ, ή ακόμα και σε τιμές nM, έναντι μιας ποικιλίας καρκινικών κυτταρικών σειρών ανθρώπινης προέλευσης. Ιδιαίτερο ενδιαφέρον ως προς την αντικαρκινική της δράση επέδειξε μία σειρά παραγώγων που φέρει τον δικυκλικό δακτύλιο της πυρρολο[2,3-c]πυριδίνης (6-αζαϊνδόλιο), και κατάλληλους υποκαταστάτες στις θέσεις 1-, 3- και 7- του ετεροκυκλικού συστήματος. Τα παράγωγα αυτά έδειξαν αξιοσημείωτη κυτταροτοξική δράση, με τιμές IC50 σε μονοψήφιες τιμές μΜ, ή ακόμα και σε τιμές nM, έναντι των καρκινικών κυτταρικών σειρών ανθρώπινης προέλευσης που ελέγχθηκαν. Τα κοινά δομικά χαρακτηριστικά των δραστικών αυτών ενώσεων ήταν η παρουσία 3-αρυλοϋποκαταστάτη (φαινυλο- ή 3- φθοροφαινυλομάδα) και η 7-αρυλαμινοϋποκατάσταση (ανιλίνη ή 3,4,5-τριμεθοξυανιλίνη), ενώ η 1- θέση του δικυκλικού συστήματος ήταν μη υποκατεστημένη ή έφερε την 4-μεθοξυβενζυλομάδα. Με βάση τις ανωτέρω παρατηρήσεις, και με σκοπό την εξαγωγή ουσιαστικών σχέσεων δομής- δράσης για αυτή την κατηγορία μορίων, στην παρούσα διπλωματική εργασία προχωρήσαμε στον σχεδιασμό και την σύνθεση αναλόγων στα οποία ο αρωματικός δακτύλιος στην 7-θέση συνδέεται απευθείας στον αζαϊνδολικό πυρήνα. Σκοπός της αλλαγής αυτής ήταν η μελέτη της επίδρασης στην κυτταροτοξική δράση που θα έχει στα νέα μόρια η αφαίρεση του ανιλινικού αζώτου της θέσης 7. Παρ’ όλο που στα νέα μόρια έχει χαθεί η πιθανή δυνατότητα σχηματισμού δεσμού υδρογόνου από το άζωτο της ανιλινικής ομάδας σε σχέση με την ένωση-οδηγό, εν τούτοις η αφαίρεση του αζώτου έχει προσδώσει στα νέα μόρια μεγαλύτερη λιποφιλία, γεγονός που ίσως επηρεάσει θετικά την δράση τους. Σχετικά με τους υποκαταστάτες που φέρουν τα νέα παράγωγα, στις θέσεις 1- και 3- του δικυκλικού συστήματος διατηρήθηκαν οι ίδιοι υποκαταστάτες που υπήρχαν στις αντίστοιχες θέσεις της ένωσης- οδηγού. Στην 7- θέση του δικυκλικού συστήματος επιλέχθηκαν σαν υποκαταστάτες ο μη υποκατεστημένος βενζολικός δακτύλιος, 2 βενζολικά παράγωγα με π-υποκατάσταση (χλώριο και ακετυλομάδα), ένα παράγωγο με μ-υποκατάσταση (νιτρομάδα) καθώς και ένα 2,4-δισυποκατεστημένο παράγωγο (2,4-διμεθοξυφαινυλομάδα). Συνολικά συντέθηκαν 20 νέα παράγωγα τα οποία αξιολογήθηκαν με τη μέθοδο ΜΤΤ ως προς την ικανότητά τους να αναστέλλουν τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό καρκινικών κυττάρων ανθρώπινης προέλευσης, ενώ παράλληλα μελετήθηκε και η επίδρασή τους έναντι φυσιολογικών κυττάρων. Από την αξιολόγηση των αποτελεσμάτων φάνηκε ότι τα παράγωγα που φέρουν την π- μεθοξυβένζυλο υποκατάσταση στη θέση 1 του πυρρολίου είναι λιγότερο δραστικά σε σχέση με τα δομικά ανάλογά τους στα οποία το πυρρολικό άζωτο δεν φέρει υποκαταστάτη. Μάλιστα, η απομάκρυνση του ογκώδους υποκαταστάτη οδήγησε σε σημαντική βελτίωση της αντικαρκινικής δράσης των παραγώγων, τα οποία πλέον παρουσιάζουν τιμές IC50 σε χαμηλό νανομοριακό επίπεδο. Η εισαγωγή υποκαταστάτη (χλωρίου ή ακετυλίου) στη θέση 4 του φαινυλίου της 7-θέσης βελτίωσε σημαντικά την δράση, με την π- χλωρο υποκατάσταση να είναι αυτή που υπερέχει. Τα μόρια με την 2,4-διμεθοξυφαινυλο υποκατάσταση στη θέση-7 ήταν τα παράγωγα με τη μεγαλύτερη δράση, με τιμές IC50 12-18 nM έναντι των καρκινικών σειρών HT-1080 και MDA-MB-231. Αξίζει επίσης να σημειωθεί ότι όλα τα δραστικά ανάλογα εμφάνισαν πολύ μικρή επίδραση έναντι της φυσιολογικής κυτταρικής σειράς AG01523, άρα εμφάνισαν έναν αρκετά μεγάλο δείκτη εκλεκτικότητας. Για να διερευνηθεί περαιτέρω ο πιθανός μηχανισμός δράσης των νέων αναλόγων, σε επόμενο στάδιο πραγματοποιήθηκε μελέτη της επίδρασης επιλεγμένων παραγώγων στον κυτταρικό κύκλο. Οι ενώσεις που ελέγχθηκαν παρουσιάζουν ανάλογη επίδραση στην καρκινική σειρά MDA-MB-231, όπου και παρατηρείται μία σημαντική αύξηση του ποσοστού των κυττάρων που βρίσκονται στη φάση G2/M, ενώ στην καρκινική σειρά MCF-7 παρατηρήθηκε μία σημαντική αύξηση του ποσοστού των κυττάρων που βρίσκονται στη φάση G2/M, για τις 4 ενώσεις, ενώ οι υπόλοιπες 2, οι οποίες σημειωτέον φέρουν την 2,4-διμεθοξυφαινυλο υποκατάσταση, προκάλεσαν μία αύξηση του πληθυσμού των κυττάρων στη φάση S του κυτταρικού κύκλου, υποδεικνύοντας πιθανή επίδραση σε κάποιο στόχο που σχετίζεται με την αντιγραφή του γενετικού υλικού του κυττάρου.The use of targeted anticancer therapeutic agents has resulted in significant progress of the anticancer therapy during the past twenty years. The two main types of molecular targeted therapy are monoclonal antibodies and small molecule kinase inhibitors, and both proved to be very effective, with limited toxicity and side effects. The majority of protein kinase inhibitors are compounds that compete ATP in its binding pocket within the active site of enzymes that are usually upregulated in several types of cancer. This inhibition results in the blockage of signaling pathways that are related with the growth and the proliferation of the cancer cells. Purine analogues often possess kinase inhibitory activity, due to their structural similarity with the adenine moiety of the ATP, and a great number of these derivatives have been already been approved as anticancer agents. With the aim to discover novel derivatives with potential cytotoxic activity, our research group has synthesized during the past years a great number of heterocyclic derivatives that possess a bicyclic ring system as the central core and contains two or more nitrogen atoms. Those derivatives exhibited promising cytotoxicity and/or kinase inhibitory activity, with IC50 values in the low μΜ or even at nM concentration, against a variety of cancer cell lines of human origin. Among them, a series of compounds, bearing the bicyclic system of pyrrolo[2,3-c]pyridine (6-azaindole), suitably substituted at positions 1-, 3- and -7 of the heterocyclic ring, proved to possess significant cytotoxic activity. The common structural features of this class of derivatives were the presence of an aryl (phenyl or 3-fluorophenyl) substituent at position -3, together with a 7-arylamino substituent (aniline or 3,4,5-trimethoxyaniline), while the position -1 of the bicyclic system was unoccupied or substituted with the 4-methoxybenzyl moiety. Based on the aforementioned findings, in this work we were involved with the design and synthesis of new analogues of the lead compounds, where the aromatic ring at position -7 has been directly attached to the 6-azaindole core, in order to investigate the effect on the cytotoxic activity caused by the removal of the aniline nitrogen atom. Although the novel derivatives lack the possibility of a hydrogen bond formation compared to the lead compounds, nevertheless, removal of the nitrogen atom also increase their lipophilicity, thus affecting their activity in a positive manner. Concerning the substitution pattern of the novel derivatives, we decided to maintain the same substituents existing at positions -1 and -3 of the lead compounds, while at position -7 of the bicyclic system the unsubstituted phenyl group, the 4- chlorophenyl, the 4-acetylphenyl group, the 3-nitrophenyl group and the 2,4-dimethoxyphenyl group were selected to be incorporated. In total, 20 novel derivatives were synthesized and were subsequently evaluated for their potential to inhibit the proliferation of cancer cell lines of human origin, with the MTT assay. Additionally, their effect on the proliferation of normal, non cancer, cells was evaluated as well. The evaluation of the cytotoxicity results showed that the derivatives substituted at position -1 of the azaindole core proved to be less potent compared to their counterparts that were not substituted on the pyrrole nitrogen. Upon removal of the bulky substituent from position -1, a remarkable improvement of the cytotoxic activity was observed, with IC50 values of the corresponding compounds decreasing to nM levels. The introduction of a substituent (chlorine or acetyl group) at position -4 of the phenyl ring significantly improved the activity, with the 4-chloro moiety being the most favourable. The analogues bearing the 2,4-dimethoxyphenyl group at position -7 proved to be the most potent, with IC50 values between 12-18nM against the HT-1080 and MDA-MB-231 cancer cell lines. Notably, all analogues showed insignificant effect on the normal cell line AG01523, thus possessing great selectivity indices. In order to investigate the possible mechanism of action of the novel derivatives, a cell cycle analysis was performed for the six most active compounds. The novel derivatives proved to cause a significant cycle arrest at phase G2/M when tested at the breast cancer cell line MDA-MB-231, but, when tested at the breast cancer cell line MCF-7, two of them, bearing the 2,4-dimethoxyphenyl substituent at position -7 of the azaindole core, demonstrated a significant cycle arrest at phase S of the cell cycle, indicating a possible effect on a target that is related to the replication of the DNA

Potassium determinations using sem, faas and xrf: some experimental notes

The calibration of Scanning Electron Microscopy coupled with Energy Dispersive X-Rays Spectrometry (SEM-EDS) for elemental quantitative analysis is an important task for characterization, provenance and absolute dating purposes. In particular the potassium determination is an important contributor to dose rate assessments in luminescence and Electron Spin Resonance (ESR) dating. Here a SEM-EDX is calibrated on different archaeological and geoarchaeological materials against standard laboratory samples as well as measured by micro X-Rays Fluorescence (mu XRF) and flame atomic absorption spectroscopy (FAAS) techniques. A common linear relationship is obtained for most elements and certain rock types used and two clear linear regressions for two types of rocks; one for granite, diorite, microgranite and sediments and another ceramic sherds, soils, marble schists, breccia. Such linear regressions become readily available for a future fast, efficient and accurate way of potassium determination.Publisher's Versio

Potassium determinations using sem, faasand xrf: Some experimental notes

The calibration of Scanning Electron Microscopy coupled with Energy Dispersive X- Rays Spec-trometry (SEM-EDS) for elemental quantitative analysis is an important task for characterization, provenance and absolute dating purposes. In particular the potassium determination is an im-portant contributor to dose rate assessments in luminescence and Electron Spin Resonance (ESR) dating. Here a SEM-EDX is calibrated on different archaeological and geoarchaeological materials against standard laboratory samples as well as measured by micro X-Rays Fluorescence (µXRF) and flame atomic absorption spectroscopy (FAAS) techniques. A common linear relationship is obtained for most elements and certain rock types used and two clear linear regressions for two types of rocks; one for granite, diorite, microgranite and sediments and another ceramic sherds, soils, marble schists, breccia. Such linear regressions become readily available for a future fast, efficient and accu-rate way of potassium determination.Publisher's Versio