Descubrimiento de inhibidores no competitivos del canal iónico TRPM8 sensible al frio

El canal iónico TRPM8 es un termocanal sensible a las bajas temperaturas, que se encuentra principalmente en neuronas sensoriales primarias de los ganglios trigéminos y dorsales. Se ha visto involucrado en hipersensibilidad al frio en contexto de dolor crónico al dañar los nervios periféricos o por el uso de fármacos quimioterapeúticos para tratar algunos tipos de cáncer. El objetivo principal de este trabajo es la búsqueda de antagonistas no competitivos del canal que podrían aliviar los síntomas de la neuropatía periférica. Para este fin se construyó un modelo del canal TRPM8 a partir del de otro miembro de la familia TRP, TRPV1 cuya estructura ha sido estudiada por crio-electromicroscopía de partícula única. El nuevo modelo de TRPM8 construido por homología se utilizó para realizar cribado virtual computacional enfocado hacia la búsqueda de sitio s de unión para los ligandos, entre sitios ya conocidos como el del mentol o la icilina, además de los giros extracelulares. Los resultados obtenidos indican que un grupo de ligandos que comparten similitudes estructurales tiende a unirse a residuos del sitio de mentol, mientras que otro, a los giros extracelulares y los de la icilina. Dicha preferencia podría explicarse por la diferente estructura química de los distintos ligandos y el entorno químico de los sitios de unión. A pesar de ello se necesitará un estudio posterior que profundice más en la forma de unión de cada ligando y el comportamiento del canal tras la interacción con este

Mechanisms of Blockade of the Muscle-Type Nicotinic Receptor by Benzocaine, a Permanently Uncharged Local Anesthetic

Most local anesthetics (LAs) are amine compounds bearing one or several phenolic rings. Many of them are protonated at physiological pH, but benzocaine (Bzc) is permanently uncharged, which is relevant because the effects of LAs on nicotinic acetylcholine (ACh) receptors (nAChRs) depend on their presence as uncharged or protonated species. The aims of this study were to assess the effects of Bzc on nAChRs and to correlate them with its binding to putative interacting sites on this receptor. nAChRs from Torpedo electroplaques were microtransplanted to Xenopus oocytes and currents elicited by ACh (IAChs), either alone or together with Bzc, were recorded at different potentials. Co-application of ACh with increasing concentrations of Bzc showed that Bzc reversibly blocked nAChRs. IACh inhibition by Bzc was voltage-independent, but the IACh rebound elicited when rinsing Bzc suggests an open-channel blockade. Besides, ACh and Bzc co-application enhanced nAChR desensitization. When Bzc was just pre-applied it also inhibited IACh, by blocking closed (resting) nAChRs. This blockade slowed down the kinetics of both the IACh activation and the recovery from blockade. The electrophysiological results indicate that Bzc effects on nAChRs are similar to those of 2,6-dimethylaniline, an analogue of the hydrophobic moiety of lidocaine. Furthermore, docking assays on models of the nAChR revealed that Bzc and DMA binding sites on nAChRs overlap fairly well. These results demonstrate that Bzc inhibits nAChRs by multiple mechanisms and contribute to better understanding both the modulation of nAChRs and how LAs elicit some of their clinical side effects.This work was supported by grants BFU2012-31359, BFU2015-66612-P, SAF2015-66275-C2-1-R and SAF2017-82977-P (AEI/FEDER, UE) from MINECO, PROMETEO/2014/11 from Generalitat Valenciana (Spain) and GRE17-01 from Universidad de Alicante. R.C. held a predoctoral fellowship from Universidad de Alicante (FPUUA36) and M.N. a predoctoral industrial fellowship from Ministerio de Economía, Industria y Competitividad (DI-16-08303)

Design and functional validation of pain modulators: crosstalk between TRAAK and TRPV1

Múltiples patologías transcurren en presencia de dolor crónico. Hasta un 20% de la población europea sufre de dolor crónico, por lo que la carga social y económica relacionada con este es muy elevada. En la actualidad sí existen tratamientos para el dolor a pesar de que su eficacia es limitada y su uso prolongado conlleva a la aparición de importantes efectos secundarios. La modulación de canales iónicos ha constituido desde hace mucho tiempo una diana para tratar el dolor. Recientemente, la escasamente explorada familia de canales iónicos K2P ha ido ganando importancia en la modulación del dolor. Cabe mencionar que la presencia de TRAAK en neuronas sensoriales, junto con su colocalización con thermoTRPs, abre una vía innovadora de tratar el dolor. El principal objetivo del presente trabajo es la identificación y validación funcional de moduladores selectivos de TRAAK o moduladores dobles de TRAAK y TRPV1. Los ensayos de cribado virtual de numerosas librerías de ligandos permitieron la identificación de moduladores putativos de TRAAK. El anatagonista de la topoisomerasa I irinotecan, mostró un incremento sostenido en el tiempo, reversible y dosis dependiente de las corrientes mediadas por TRAAK. Irinotecan aumentó la hiperpolarización de los potenciales de acción en un modelo neuropático de neuronas sensoriales de los ganglios de la raíz dorsal inducido por taxol. Los antagonistas del receptor de histamina 1, astemizol y terfenadin, disminuyeron la corriente basal mediada por TRAAK de forma reversible y dosis dependiente. Terfenadin causó el disparo de potenciales de acción a través de despolarización del potencial de membrana de las neuronas sensoriales de los ganglios de la raíz dorsal. AG1529 no tuvo efecto sobre la corriente de TRAAK, pero causó antagonismo sobre TRPV1. De forma preferente y reversible bloqueó la corriente de TRPV1 inducida por capsaicina y afectó marginalmente la corriente del canal inducida por pH ácido. No tuvo efecto sobre la apertura de TRPV1 provocada por voltaje o temperatura alta. Mostró reactividad cruzada sobre TRPM8 y TRPA1. El modelo in silico de acoplamiento molecular localizó AG1529 en el bolsillo de unión de capsaicina. El desplazamiento de la EC50 de capsaicina hacia mayores valores apoya la hipótesis de antagonismo de AG1529 competitivo con capsaicina. El compuesto fue capaz de bloquear el disparo de potenciales de acción neuronales inducidos por capsaicina. A pesar de las muchas incógnitas que deben ser exploradas en mayor detalle, este trabajo establece las bases de una nueva forma de modular el dolor crónico.Multiple pathologies elapse in presence of chronic pain. Up to 20% of EU population suffers from chronic pain, thus the related social and economic burden is very high. Currently, pain treatments do exist, although their efficacy is limited and their prolonged use leads to important side effects. Ion channels modulation has constituted a target to treat pain since a long time. Recently, the poorly explored K2P channels family has gained importance in pain modulation. Noteworthy, TRAAK presence in sensory neurons, together with its co-localization with thermoTRPs, opens a leeway to address pain in an innovative way. In the present work, the identification and functional validation of TRAAK selective modulators or double modulators of TRAAK and TRPV1, constituted the main goal. Virtual screening assays of numerous ligand libraries enabled the identification of TRAAK putative modulators. Topoisomerase I antagonist irinotecan showed TRAAK mediated current increase in a time-sustained, reversible and dose-dependent manner. Irinotecan increased action potential hyperpolarization state in a neuropathic pain model of rat DRG neurons, induced by taxol. Histamine receptor 1 antagonists astemizol and terfenadine decreased basal TRAAK current in a dose-dependent and reversible manner. Terfenadine produced depolarization induced neuronal firing in primary DRG neurons. AG1529 exerted no effect on TRAAK current but caused TRPV1 antagonism. It preferentially and reversibly blocked capsaicin-induced TRPV1 current and marginally affected acid pH-elicited channel current. It had no effect on voltage- or heat-induced TRPV1 gating. It showed cross-reactivity with TRPM8 and TRPA1. In silico docking model located AG1529 on capsaicin binding pocket and the shift of its EC50 to higher value supported the hypothesis of capsaicin-competitive antagonism of AG1529. The compound was also able to block capsaicin-induced neuronal firing. Despite there are lot of unknowns which must be explored, this work sat up the funds of a new way to modulate chronic pain