Efecto del tratamiento con diazepam durante la inducción de las alteraciones neuropatológicas en la encefalomielitis autoinmune experimental

Tesis (Doctor en Ciencias Químicas) - - Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas, 2016Las bz son Clásicamente conocidas como tranquilizantes menores, son drogas que poseen propiedades farmacológicas de ansiolíticos, hipnóticos, miorelajantes de acción central, anticonvulsivantes e inducen sedación. Esta acción es mediada por el receptor central de benzodiacepinas (CBR), también conocido como receptor GABAA (Ácido y-aminobutírico) de localización principalmente neuronal. Las benzodiacepinas, cuentan también con un sitio de unión alternativo, conocido como receptor periférico de benzodiacepinas (PBR), o proteína translocadora de 18 kDa (TSPO). Su expresión es abundante en órganos endocrinos, piel, corazón, hígado, y en sistema nervioso central (SNC) se encuentra asociado con células de la microglía. TSPO también se encuentra presente en células inmunes y la acción de benzodiacepinas sobre TSPO ha sido asociada a algunas propiedades inmunomodulatorias sobre funciones del sistema inmune. La encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) es un modelo animal que reproduce muchas de las características clínicas, patológicas e inmunológicas de la enfermedad humana esclerosis múltiple (EM). Tanto la enfermedad humana como el modelo experimental se caracterizan por una respuesta inmune contra antígenos del SNC llevando a una patología inflamatoria. Se desencadena por la activación periférica de células T luego de entrar en contacto con células dendríticas (CD5). Consecuentemente, estos linfocitos se activan, proliferan, producen mediadores inflamatorios, y aumentan la expresión de adhesinas e integrinas que permiten acceder al SNC. Allí, son reactivados por células presentadoras de antígenos locales o que llegan desde periferia, favoreciendo el reclutamiento de otros leucocitos, entre ellos macrófagos (M4s), que exacerban la inflamación, favorecen la degeneración de oligodendrocitos, destrucción de la mielina y daño axonal. En este trabajo demostramos que animales desafiados para la EAE que fueron tratados con diazepam (Dz), presentaron una menor incidencia de la patología, parámetros clínicos atenuados, y una reacción de hipersensibilidad de tipo retardada (DTH) contra la PBM (proteína básica de mielina) disminuida. Luego caracterizamos la respuesta inmunológica durante la etapa aguda de la patología. En periferia (ganglios poplíteos), no se detectaron grandes cambios en cuanto al número de células aisladas y a la distribución de las poblaciones celulares mayoritarias entre los grupos experimentales. Sin embargo, en SNC de animales EAE tratados con Dz que no presentaron signos clínicos, se aislaron menos células infiltrantes y tanto las poblaciones de M4s, microglía activada así como también la población de linfocitos T CD4 infiltrantes productores de lEN-y e IL-17 resultaron disminuidas con respecto a los animales EAE tratados con vehículo. Posteriormente, evaluamos el efecto directo de esta droga sobre diferentes poblaciones celulares que participan activamente durante la inducción y desarrollo de la patología. En cultivos de linfocitos T, principales responsables del desarrollo de la patología, no se observó un efecto tóxico ni pro-apoptótico del Dz; sin embargo, la adición de esta droga redujo la proliferación y producción de citocinas proinflamatorias. En CDs, población importante para la iniciación de respuestas específicas de antígeno, el Dz no afectó la viabilidad. Sin embargo, cuando las CDs fueron estimuladas con LPS en presencia de Dz, se observó una reducción en las moléculas involucradas en la presentación antigénica, en la producción de citocinas pro-inflamatorias tales como IL-12, IL-6 y TNF-a y un aumento en los niveles de la citocina anti-inflamatoria IL-lO. Por otra parte, M4s tratados con Dz presentaron menor secreción de citocinas pro-inflamatorias, menores niveles de expresión de la enzima óxido nítrico sintasa inducible (¡NOS) y niveles elevados de las citocinas antiinflamatorias, IL-10 y TGF-, indicando que esta droga lleva a los M4s a adquirir un fenotipo de activación alternativo (M2). Por último, nos enfocamos en identificar el receptor responsable de los efectos ejercidos por el Dz en linfocitos T CD4+. Nuestros resultados indican que solo un porcentaje bajo de estas células expresa la subunidad y2 del receptor GABAA; sin embargo presentan una expresión generalizada de TSPO. Esto lleva a pensar que los efectos inducidos por Dz en esta población celular serian mediados por el receptor TSPO. Es importante mencionar que el mismo se encuentra presente en células de la microglía en pacientes con EM, como en animales con EAE y que cambios en sus niveles de expresión permiten emplearlo como un buen marcador molecular de neuroinflamación en nuestro modelo experimental. En conclusión podemos decir que Dz actúa como una potente droga inmunosupresora tanto in vivo sobre el desarrollo de la EAE como in vitro sobre células involucradas durante la evolución de la patología, siendo una herramienta importante para modular funciones del sistema inmune en enfermedades inflamatorias.Fil: Fernández Hurst, Nicolás. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas; Argentina

Diazepam Impairs Innate and Adaptive Immune Responses and Ameliorates Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

Currently there is increasing attention on the modulatory effects of benzodiazepines on the immune system. Here, we evaluate how Diazepam (DZ) affects both innate and adaptive immunity. We observed that treatment with DZ and Lipopolysaccharide (LPS) on macrophages or dendritic cells (DCs) induced a defective secretion of IL-12, TNF-α, IL-6 and a lesser expression of classical activation markers as NO production and CD40 in comparison with LPS condition. More importantly, mice pre-treated with DZ and then challenged to LPS induced-septic shock showed reduced death. The DZ treatment shifted the LPS-induced pro-inflammatory cytokine production of peritoneal cells (PCs) to an anti-inflammatory profile commanded by IL-10. In agreement with this, DZ treatment prevented LPS-induced DC ability to initiate allogeneic Th1 and Th17 responses in vitro when compared with LPS-matured DC. Since these inflammatory responses are the key in the development of the experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), we treated EAE mice preventively with DZ. Mice that received DZ showed amelioration of clinical signs and immunological parameters of the disease. Additionally, DZ reduced the release of IFN-γ and IL-17 by splenocytes from untreated sick mice in vitro. For this reason, we decided to treat diseased mice therapeutically with DZ when they reached the clinical score of 1. Most importantly, this treatment ameliorated clinical signs, reduced the MOG-specific inflammatory cytokine production and prevented axonal damage. Altogether, these results indicate that DZ is a potent immunomodulator capable of controlling undesired innate and adaptive immune responses, both at the beginning of these responses and also once they have started.Fil: Falcón, Cristian Roberto. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - San Luis. Instituto Multidisciplinario de Investigaciones Biológicas de San Luis. Universidad Nacional de San Luis. Facultad de Ciencias Físico Matemáticas y Naturales. Instituto Multidisciplinario de Investigaciones Biológicas de San Luis; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Córdoba. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba; ArgentinaFil: Fernández Hurst, Nicolás. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Córdoba. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba; ArgentinaFil: Vivinetto, Ana Laura. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Córdoba. Instituto de Investigación Médica Mercedes y Martín Ferreyra. Universidad Nacional de Córdoba. Instituto de Investigación Médica Mercedes y Martín Ferreyra; ArgentinaFil: Lopez, Pablo. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Córdoba. Instituto de Investigación Médica Mercedes y Martín Ferreyra. Universidad Nacional de Córdoba. Instituto de Investigación Médica Mercedes y Martín Ferreyra; ArgentinaFil: Zurita, Adolfo Ramón. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - San Luis. Instituto Multidisciplinario de Investigaciones Biológicas de San Luis. Universidad Nacional de San Luis. Facultad de Ciencias Físico Matemáticas y Naturales. Instituto Multidisciplinario de Investigaciones Biológicas de San Luis; ArgentinaFil: Gatti, Gerardo Alberto. Fundación Para El Progreso de la Medicina; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Córdoba. Centro de Investigaciones en Bioquímica Clínica e Inmunología; ArgentinaFil: Cervi, Laura Alejandra. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Córdoba. Centro de Investigaciones en Bioquímica Clínica e Inmunología; ArgentinaFil: Monferran, Clara Graciela. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Córdoba. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba; ArgentinaFil: Roth, German Alfredo. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Córdoba. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba; Argentin

Diazepam Inhibits Proliferation of Lymph Node Cells Isolated from Rats with Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

Objective: Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is an inflammatory demyelinating disease with similar-ities to human multiple sclerosis involving peripheral activa-tion of autoreactive T cells which infiltrate the central ner-vous system and react to self antigens leading to damage. In previous studies, we have demonstrated that treatment with diazepam decreases the incidence and histological signs as-sociated with the disease and diminishes immunological re-sponses. The aim of the present work was to evaluate direct effects of diazepam on isolated T cells involved in immune responses during the development of EAE. Methods: Ani-mals were sensitized with whole myelin to induce EAE and sacrificed during the acute phase of the disease. In mono-nuclear cells isolated from popliteal lymph nodes, cell viabil-ity, apoptosis induction, proliferation and cytokine produc-tion were evaluated. Results: Diazepam did not have a toxic or proapoptotic effect on the cells, at least up to the concen-tration of 25 μ M , but proliferation, CD8+ T-cell activation and proinflammatory cytokine production were dose-depend-ently decreased. Conclusions: Diazepam has a direct inhibi-tory effect on the proliferation and activation of T lympho-cytes isolated from the main lymphoid organ involved in disease onset and this could be one of the mechanisms that contribute to the beneficial effect previously observed with diazepam in vivo during EAE development.Fil: Fernández Hurst, Nicolás. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Córdoba. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba; ArgentinaFil: Bibolini, Mario Javier. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Córdoba. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba; ArgentinaFil: Roth, German Alfredo. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Córdoba. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba; Argentin

GABAergic agonists modulate the glutamate release from frontal cortex synaptosomes of rats with experimental autoimmune encephalomyelitis

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is a model that mimics many of the clinical and pathological features of multiple sclerosis. We have previously found a significant reduction in the GABAergic regulation of glutamate release from synaptosomes of EAE rats during the acute stage of the disease. In order to deepen into the possible metabolic pathways responsible for this alteration, in this work we evaluate the direct effect of different GABAergic agonists on the glutamate release and synapsin I phosphorylation in synaptosomes from the frontal cortex of control and EAE animals. The results show that all tested GABA agonists negatively modulate control synaptosomes, downregulating glutamate release and synapsin I phosphorylation on P-site 3, while synaptosomes from EAE group are less responsive to GABAergic agonists, with no change in their sensitivity to allosteric modulators. GABA and the GABA receptor agonists Muscimol (GABAA agonist) and Baclofen (GABAB agonist) caused a decrease in glutamate release paralleled by a similar reduction in synapsin I phosphorylation. In the case of the benzodiazepines Diazepam and Clonazepam (GABAA allosteric agonists) there was a higher effect on synapsin I phosphorylation than in glutamate release. These results indicate that the extent of GABAergic modulation of presynaptic terminals depends on the type of agonist employed and this regulation is altered in the frontal cortex during the acute phase of EAE.Fil: Fernández Hurst, Nicolás. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Córdoba. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba; ArgentinaFil: Chanaday Ricagni, Natalí Luján. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Córdoba. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba; ArgentinaFil: Roth, German Alfredo. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Córdoba. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba; Argentin

Diazepam treatment reduces inflammatory cells and mediators in the central nervous system of rats with experimental autoimmune encephalomyelitis

Benzodiazepines are psychoactive drugs and some of them also affect immune cells. We here characterized the inflammatory and infiltrating immune cells in the central nervous system (CNS) during the acute phase of experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in animals treated with Diazepam. Also, we evaluated the expression of Translocator Protein (18kDa) (TSPO), which is a biomarker of neuroinflammatory diseases. The results indicate that Diazepam exerts protective effects on EAE development, decreasing the incidence of the disease and reducing the number of inflammatory cells in CNS, with a concomitant decrease of TSPO levels in brain tissue and CNS inflammatory CD11b+ cells.Fil: Fernández Hurst, Nicolás. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Córdoba. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba; ArgentinaFil: Zanetti, Samanta Romina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Bahía Blanca. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de Bahía Blanca. Universidad Nacional del Sur. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de Bahía Blanca; ArgentinaFil: Baez, Natalia Soledad. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Córdoba. Centro de Investigaciones en Bioquímica Clínica e Inmunología; ArgentinaFil: Bibolini, Mario Javier. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Córdoba. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba; ArgentinaFil: Bouzat, Cecilia Beatriz. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Bahía Blanca. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de Bahía Blanca. Universidad Nacional del Sur. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de Bahía Blanca; ArgentinaFil: Roth, German Alfredo. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Córdoba. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba; Argentin