Trypanosoma cruzi: amastigote polymorphism defined by monoclonal antibodies

We have raised monoclonal antibodies (mAbs) directed towards amastigote forms of Trypanosoma cruzi, and shown that mAbs 1D9 and 4B9 are carbohydrate while mAb 4B5 activity is resistant to periodate oxidation of the antigen. Here we used an ELISA to quantitate and compare the expression of surface epitopes on fixed parasites among different parasite isolates. The expression of markers varied among T. cruzi amastigotes isolated from infected cells or after extracellular differentiation of trypomastigotes. Moreover, we also observed an extensive polymorphic expression of these epitopes among amastigotes derived from different strains and clones. For instance, mAb 2C2 strongly and evenly reacted with 9 strains and clones (G, Y, CL, Tulahuen, MD, and F, and clones Sylvio X-10/4, D11, and CL.B), with absorbance at 492 nm (A492 nm) from 0.6 to 0.8. By contrast, mAb 4B5 had a higher expression in Tulahuen amastigotes (around 0.9 at 492 nm) whereas its reactivity with amastigotes from clones CL.B, Sylvio X-10/4 and D11 was much lower (around 0.4). mAb 1D9 displayed an interesting pattern of reactivity with amastigotes of the different strains and clones (A492 nm of G>D11³Sylvio X-10/4 = MD>Tulahuen = F = Y>CL>CL.B). Finally, we observed that mAb 4B9 had the lowest reaction with the parasites studied, with higher values of A492 nm with Y strain (around 0.6) and lower values with Tulahuen, F and CL.B strains (around 0.2). Immunoblotting analysis also showed extensive variations among amastigotes of the various parasite isolates and mAbs 4B9, 1D9 and 4B5 revealed significant differences in expression between clones and parental strains. These data describe a previously uncharacterized polymorphism of T. cruzi amastigote surface components.Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)UNIFESPSciEL

A novel reiterated family of transcribed oligo(A)-terminated, interspersed DNA elements in the genome of Trypanosoma cruzi

We report the molecular characterization of a novel reiterated family of transcribed oligo(A)-terminated, interspersed DNA elements in the genome of Trypanosoma cruzi. Steady-state level of transcripts of this sequence family appeared to be developmentally regulated, since only in the replicative forms the parasite showed expression of related sequences with a major band around 3 kb. The presence of frame shifts or premature stop codons predicts that transcripts are not translated. The sequence family also contains truncated forms of retrotransposons elements that may become potential hot spots for retroelement insertion. Sequences homologous to this family are interspersed at many chromosomes including the subtelomeric regions.Escola Paulista de Medicina Departamento de Microbiologia, Imunologia e ParasitologiaNorthwestern University Medical School Departments of Pathology and Microbiology-ImmunologyUniversidad Central de Venezuela Instituto de Biologia Experimental Laboratorio de Genetica MolecularUniversidad de Antofagasta Departamento de Tecnologia MédicaUNIFESP, EPM, Depto. de Microbiologia, Imunologia e ParasitologiaSciEL

Isolation and characterization of group II genes from 85/sialidase superfamily expresses at amastigote stage of Trypanosoma cruzi

O Trypanosoma cruzi e o protozoario flagelado causador da Doenca de Chagas ou tripanosomiase americana, que atinge milhoes de pessoas na America Latina. Esse microorganismo apresenta um ciclo de vida complexo e o estagio evolutivo amastigota e a forma de replicacao do parasita encontrada no hospedeiro mamifero. Os amastigotas se caracterizam pela presenca cie um flagelo curto e forma oval, e sao fundamentais para a persistencia da infeccao pelo T. cruzi no hospedeiro vertebrado. Pouco se sabe sobre a constituicao bioquimica das formas amastigotas, tendo sido poucos os genes isolados e caracterizados ate o presente. No entanto sabe-se que a superfamilia genica das gp85/sialidases, que codificam para antigenos de superficie com papel importante na adesao e invasao do parasita, possui membros que sao expressos tambem nas formas amastigotas do T. cruzi. No presente trabalho e feita a caracterizacao de cDNAs de formas amastigotas intracelulares da cepa Sylvio (clone X10/4) do Trypanosoma cruzi. Esses cDNAs foram denominados TcSx e foram isolados com sonda de um gene que codifica uma glicoproteina de superficie de 85 kilodaltons das formas tripomastigotas do parasita, descrito anteriormente na literatura. Os dados mostram que o gene TcSx23 e seus similares (TcSx2, TcSx7, TcSxl8, TcSx19 e TcSx32) constituem novos genes que podem ser inseridos na familia 11 das gp85/sialidases. A analise das sequencias de nucleotideos e de aminoacidos revela diferencas significativas entre TcSx23 e as proteinas SA85 -1, ASP-1 e ASP-2 que sao expressas nas formas amastigotas. O gene TcSx23 e transcrito e traduzido nas formas tripomastigotas e amastigotas gerando peptideos de -80 e 50 kDa e anticorpos anti-TcSx23 mostram que a localizacao celular dos epitopos reconhecidos por esses anticorpos difere nas duas formas do parasita, sendo de superficie em tripomastigotas e intracelular nos amastigotas. Alguns motivos peptidicos presentes em membros da familia 11 das gp85/sialidases e que desempenham papel de adesinas, por exemplo Tc85 e gp82, estao ausentes em TcSx23. E possivel que o polipeptideo TcSx23 e...(au)BV UNIFESP: Teses e dissertaçõe

Estudos imunoquímicos e moleculares de antígenos de superfície de formas amastigotas do Trypanosoma cruzi

As formas amastigotas do Trypanosoma cruzi foram estudadas sob os aspectos imunoquimicos e moleculares das suas principais moleculas de superficie. Diversos anticorpos monoclonais e soros capazes de reagir com essas moleculas foram utilizados na caracterizacao dos antigenos de superficie, notadamente Ssp-4, a glicoproteina majoritaria desse estagio do parasita. A padronizacao de um ensaio imunoenzimatico (ELISA) de amastigotas permitiu a quantificacao e a diferenciacao da expressao de antigenos de superficie em diferentes cepas e clones do T. cruzi de maneira precisa e equivalente a observada com outras metodologias. Alem disso, atraves de ELISA de competicao mostrou-se que os monossacarideos fucose e galactose inibem especificamente a reatividade dos anticorpos monoclonais 2C2 e 4B9. O estudo da identidade de Ssp-4 com outros antigenos de superficie de amastigotas do T. cruzi nao identificou moleculas que apresentassem semelhancas fortes o suficiente para viabilizar o uso de anticorpos ou sondas especificas como reagentes que permitissem a clonagem genica de Ssp-4, nem tampouco foi possivel sequenciar regioes peptidicas internas de Ssp-4 purificada de modo a construir oligonucleotideos degenerados utilizaveis como sondas para a triagem de bancos de cDNAs de amastigotas. Embora a clonagem do(s) gene(s) codificador (ES) de Ssp-4 nao tenha sido alcancada, foi possivel isolar clones recombinantes de um banco de cDNAs de amastigotas do clone Sylvio X-10/4, apos triagem com a sonda de Tt34c1, que codifica uma glicoproteina de superficie de 85 kDa de tripomastigotas. Esses clones recombinantes foram denominados sx12, sx23, sx38 e sx42 e apresentam insertos que variam de 1,5 a 2,0 kb de tamanho. A analise de æsouthern-blotÆ de DNA genomico do Sylvio X-10/4 digerido com EcoRI/XhoI, utilizando os quatro diferentes clones de cDNA e Tt34c1 como sondas, indicou que esses clones provavelmente constituem uma familia genica. Alem disso, os clones sx foram mapeados em muitas bandas cromossomais do T. cruzi separadas por æPulsed Field Gel ElectrophoresisÆ. A analise de ænorthern-blotÆdo RNA total de tripomastigotas, amastigotas e epimastigotas do Sylvio X-10/4 revelou que o clone sx23 reconhece fortemente em tripomastigotas uma banda de ~5,5 kb, mas fracamente em amastigotas, assim como Tt34c1. Ao mesmo tempo, o clone sx23 hibridou com MTS-gp82 (clone J18) e MTS-gp90 (clone T7) em experimentos de ædot-blotÆ. Esses resultados sugerem que o clone sx23 (inserto de 2,0 kb) pode ser um novo membro da superfamilia das sialidases/gp85 que e expresso em tripomastigotas e amastigotas. Por outro lado, os clones sx12, sx38 e sx42 reconheceram duas bandas fracas de ~2,3 kb e ~8,0 kb somente em amastigotas, sugerindo que esses clones podem pertencer a uma nova familia cujos membros sao especificamente expressos em amastigotas. Nenhum dos nossos clones sx hibridou com o clone TcA7 de amastina em experimento de ædot-blotÆ. As estapas seguintes consistirao no sequenciamento e completa caracterizacao dos clones sx, tentando identificar os possiveis antigenos codificados pelos clones amastigota-especificosBV UNIFESP: Teses e dissertaçõe

SHORT COMMUNICATION - A Novel Reiterated Family of Transcribed Oligo(A)-terminated, Interspersed DNA Elements in the Genome of Trypanosoma cruzi

We report the molecular characterization of a novel reiterated family of transcribed oligo(A)-terminated, interspersed DNA elements in the genome of Trypanosoma cruzi . Steady-state level of transcripts of this sequence family appeared to be developmentally regulated, since only in the replicative forms the parasite showed expression of related sequences with a major band around 3 kb. The presence of frame shifts or premature stop codons predicts that transcripts are not translated. The sequence family also contains truncated forms of retrotransposons elements that may become potential hot spots for retroelement insertion. Sequences homologous to this family are interspersed at many chromosomes including the subtelomeric regions