Cellulase production, recovery, formulation and application : a wastewater biorefinery approach

Orientadora: Profª. Drª. Luciana Porto de Souza VandenbergheCoorientador: Profº. Drº. Carlos Ricardo SoccolTese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Tecnologia, Programa de Pós-Graduação em Engenharia de Bioprocessos e Biotecnologia. Defesa : Curitiba, 19/03/2018Inclui referências: p. 165-179Resumo : A produção de celulase utilizando resíduos como substrato tem sido bem descrita, pois é uma estratégia interessante para reduzir os custos do processo produtivo. Esta pesquisa descreveu pela primeira vez o uso de efluentes sanitários como base para o meio de cultivo para a produção de celulase pela cepa Trichoderma harzianum. A lactose e a peptona foram selecionadas como fontes de carbono e nitrogênio. O uso de efluentes sanitários como meio de cultivo proporcionou um aumento na produção de celulases em comparação com o meio sintético. A produção em reatores de coluna de bolha (BCR) e tanque agitado (STR) foi avaliada, sendo que a máxima atividade e produtividade alcançadas foram de 31 U/mL e 645 U/Lh, respectivamente, com o BCR. A demanda química de oxigênio (DQO) e a concentração de nitrogênio foram reduzidas em 98% e 78%, respectivamente, durante o processo de fermentação. A concentração por ultrafiltração levou à recuperação de 73,5% da celulase, usando uma membrana de 30 kDa, resultando em concentração de atividade de 4,23 vezes e fouling de membrana de 19,81%. O processo de concentração por membranas levou à redução da DQO e da concentração de nitrogênio em 81,37% e 52,9%, respectivamente. O pH e a temperatura ótima ficaram entre 4 e 5 e 50 a 70ºC, respectivamente. A constante de Michaelis-Menten (Km) de endoglucanases e ?- glucosidases foram determinados como 63 M e 0.39 mM, respectivamente. A concentração de 10 g/L de glicose inibiu cerca de 45% da atividade da ?- glucosidase. A eletroforese em condições desnaturantes (SDS-PAGE) e zimograma revelaram massas moleculares de 48, 43 e 25 kDa. Sorbitol (50% m/v) e ácido benzóico (0,05% m/v) foram adicionados ao extrato líquido e levaram à estabilidade da formulação de celulase em cerca de 100% após 30 dias. O extrato concentrado de enzima foi seco em um spray-dryer com adição de maltodextrina a 20% (m/v) e temperatura de entrada de 120ºC, resultando em maior rendimento em atividade enzimática (40,6%) e estabilidade (85%) após 60 dias. As enzimas formuladas foram aplicadas na hidrólise de cachos vazios de palma (Empty Fruit Bunches - EFB) e resíduo de estação de tratamento de efluentes (ETE). A fração celulósica do resíduo de ETE foi caracterizada (21,3%) e seu potencial para ser recuperado e hidrolisado com uma mistura enzimática avaliada. A aplicação da celulase formulada para a hidrólise dos resíduos EFB e de ETE resultou em rendimentos de glicose de 37,59 mg/gcelulose e 21,17 mg/gcelulose, respectivamente. O resíduo de ETE tem potencial para ser usado como fonte de açúcares fermentescíveis pela hidrólise enzimática, uma vez que grandes quantidades de tais resíduos são produzidas mensalmente na planta de tratamento estudada (4,07 toneladas). Palavras-chave: Celulase. Biorrefinaria. Efluentes sanitários. Biorreator. Formulação.Abstract: Cellulase production using residues as substrate has been well described, as it is an interesting strategy of reducing the costs of processes. This research described for the first time the use of sanitary wastewater as a culture base medium for cellulase production by the fungus Trichoderma harzianum. Lactose and peptone were selected as carbon and nitrogen sources. The use of domestic wastewater as the culture medium led to an increase of the enzyme activity, compared to synthetic medium. The production in bubble column (BCR) and stirred tank (STR) reactors was tested, where the maximum cellulase activity and productivity of 31 U/mL and 645 U/Lh were achieved, respectively, with BCR. The chemical oxygen demand (COD) and nitrogen concentration were reduced by 98% and 78%, respectively, during the fermentation process. The concentration by ultrafiltration led to cellulase recovery of 73.5% using a 30 kDa membrane, resulting in activity concentration of 4.23-fold with membrane fouling of 19.81%. The membrane process led to the reduction of COD and nitrogen concentration by 81.37% and 52.9%, respectively. The optimum pH and temperature where found to be between 4 and 5 and 50 and 70ºC, respectively. Michaelis-Menten constant (Km) of endoglucanases and ?-glucosidases were determined as 63 M and 0.39 mM, respectively. The concentration of 10 g/L of glucose inhibited around 45% of the ?-glucosidases activity. Denaturing gel electrophoresis (SDS-PAGE) and zymogram revealed molecular weights of 48, 43 and 25 kDa. Sorbitol (50% w/v) and benzoic acid (0.05% w/v) were added to the liquid extract and led to cellulase formulation stability at around 100% after 30 days. Concentrated enzyme extract was dried in a spray-dryer with the addition of maltodextrin at 20% (w/v) and inlet temperature of 120ºC, resulting in highest cellulase activity yield (40.6%) and stability (85%) after 60 days. The formulated enzymes were applied in the hydrolysis of palm oil empty fruit bunches (EFB) and wastewater treatment plant residue (WWTP). The cellulosic fraction of the WWTP residue was characterized (21.3%) and its potential to be recovered and hydrolyzed with an in-house enzymatic blend evaluated. The application of the formulated cellulase for the hydrolysis of EFB and WWTP residue resulted in glucose yields of 37.59 mg/gcellulose and 21.17 mg/gcellulose, respectively. The WWTP residue has a potential to be used as a source of fermentable sugars by the enzymatic hydrolysis, since huge amounts of such residue is monthly produced in the treatment plant (4.07 tons). Key-words: Cellulase. Biorefinery. Sanitary wastewater. Bioreactor. Formulation

Cellulase production, recovery, formulation and application : a wastewater biorefinery approach

Orientadora: Profª. Drª. Luciana Porto de Souza VandenbergheCoorientador: Profº. Drº. Carlos Ricardo SoccolTese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Tecnologia, Programa de Pós-Graduação em Engenharia de Bioprocessos e Biotecnologia. Defesa : Curitiba, 19/03/2018Inclui referências: p. 165-179Resumo : A produção de celulase utilizando resíduos como substrato tem sido bem descrita, pois é uma estratégia interessante para reduzir os custos do processo produtivo. Esta pesquisa descreveu pela primeira vez o uso de efluentes sanitários como base para o meio de cultivo para a produção de celulase pela cepa Trichoderma harzianum. A lactose e a peptona foram selecionadas como fontes de carbono e nitrogênio. O uso de efluentes sanitários como meio de cultivo proporcionou um aumento na produção de celulases em comparação com o meio sintético. A produção em reatores de coluna de bolha (BCR) e tanque agitado (STR) foi avaliada, sendo que a máxima atividade e produtividade alcançadas foram de 31 U/mL e 645 U/Lh, respectivamente, com o BCR. A demanda química de oxigênio (DQO) e a concentração de nitrogênio foram reduzidas em 98% e 78%, respectivamente, durante o processo de fermentação. A concentração por ultrafiltração levou à recuperação de 73,5% da celulase, usando uma membrana de 30 kDa, resultando em concentração de atividade de 4,23 vezes e fouling de membrana de 19,81%. O processo de concentração por membranas levou à redução da DQO e da concentração de nitrogênio em 81,37% e 52,9%, respectivamente. O pH e a temperatura ótima ficaram entre 4 e 5 e 50 a 70ºC, respectivamente. A constante de Michaelis-Menten (Km) de endoglucanases e ?- glucosidases foram determinados como 63 M e 0.39 mM, respectivamente. A concentração de 10 g/L de glicose inibiu cerca de 45% da atividade da ?- glucosidase. A eletroforese em condições desnaturantes (SDS-PAGE) e zimograma revelaram massas moleculares de 48, 43 e 25 kDa. Sorbitol (50% m/v) e ácido benzóico (0,05% m/v) foram adicionados ao extrato líquido e levaram à estabilidade da formulação de celulase em cerca de 100% após 30 dias. O extrato concentrado de enzima foi seco em um spray-dryer com adição de maltodextrina a 20% (m/v) e temperatura de entrada de 120ºC, resultando em maior rendimento em atividade enzimática (40,6%) e estabilidade (85%) após 60 dias. As enzimas formuladas foram aplicadas na hidrólise de cachos vazios de palma (Empty Fruit Bunches - EFB) e resíduo de estação de tratamento de efluentes (ETE). A fração celulósica do resíduo de ETE foi caracterizada (21,3%) e seu potencial para ser recuperado e hidrolisado com uma mistura enzimática avaliada. A aplicação da celulase formulada para a hidrólise dos resíduos EFB e de ETE resultou em rendimentos de glicose de 37,59 mg/gcelulose e 21,17 mg/gcelulose, respectivamente. O resíduo de ETE tem potencial para ser usado como fonte de açúcares fermentescíveis pela hidrólise enzimática, uma vez que grandes quantidades de tais resíduos são produzidas mensalmente na planta de tratamento estudada (4,07 toneladas). Palavras-chave: Celulase. Biorrefinaria. Efluentes sanitários. Biorreator. Formulação.Abstract: Cellulase production using residues as substrate has been well described, as it is an interesting strategy of reducing the costs of processes. This research described for the first time the use of sanitary wastewater as a culture base medium for cellulase production by the fungus Trichoderma harzianum. Lactose and peptone were selected as carbon and nitrogen sources. The use of domestic wastewater as the culture medium led to an increase of the enzyme activity, compared to synthetic medium. The production in bubble column (BCR) and stirred tank (STR) reactors was tested, where the maximum cellulase activity and productivity of 31 U/mL and 645 U/Lh were achieved, respectively, with BCR. The chemical oxygen demand (COD) and nitrogen concentration were reduced by 98% and 78%, respectively, during the fermentation process. The concentration by ultrafiltration led to cellulase recovery of 73.5% using a 30 kDa membrane, resulting in activity concentration of 4.23-fold with membrane fouling of 19.81%. The membrane process led to the reduction of COD and nitrogen concentration by 81.37% and 52.9%, respectively. The optimum pH and temperature where found to be between 4 and 5 and 50 and 70ºC, respectively. Michaelis-Menten constant (Km) of endoglucanases and ?-glucosidases were determined as 63 M and 0.39 mM, respectively. The concentration of 10 g/L of glucose inhibited around 45% of the ?-glucosidases activity. Denaturing gel electrophoresis (SDS-PAGE) and zymogram revealed molecular weights of 48, 43 and 25 kDa. Sorbitol (50% w/v) and benzoic acid (0.05% w/v) were added to the liquid extract and led to cellulase formulation stability at around 100% after 30 days. Concentrated enzyme extract was dried in a spray-dryer with the addition of maltodextrin at 20% (w/v) and inlet temperature of 120ºC, resulting in highest cellulase activity yield (40.6%) and stability (85%) after 60 days. The formulated enzymes were applied in the hydrolysis of palm oil empty fruit bunches (EFB) and wastewater treatment plant residue (WWTP). The cellulosic fraction of the WWTP residue was characterized (21.3%) and its potential to be recovered and hydrolyzed with an in-house enzymatic blend evaluated. The application of the formulated cellulase for the hydrolysis of EFB and WWTP residue resulted in glucose yields of 37.59 mg/gcellulose and 21.17 mg/gcellulose, respectively. The WWTP residue has a potential to be used as a source of fermentable sugars by the enzymatic hydrolysis, since huge amounts of such residue is monthly produced in the treatment plant (4.07 tons). Key-words: Cellulase. Biorefinery. Sanitary wastewater. Bioreactor. Formulation

Cultivation of Agaricus blazei on Pleurotus spp. spent substrate

The aim of this work was the use of Pleurotus ostreatus and Pleurotus sajor-caju for the previous lignocellulolytic decomposition of banana tree leaf straw and the further use of the degraded straw as substrate for the culture of Agaricus blazei. For optimising the production of A. blazei in terms of yield (Y%) and biological efficiency (BE%), adjustments to the composition of the substrate were evaluated in a 2(5) experimental design. The following components were tested in relation to % of substrate dry mass: urea (1 and 10%), rice bran (10 or 20%) or ammonium sulphate (0 or 10%), inoculum (10 or 20%) and the casing material (subsoil or burned rice husks). The best results (79.71 Y% and 6.73 BE%) were found when the substrate containing 10% of rice bran, without ammonium sulphate, inoculated with 20% and covered with subsoil was used.<br>O cultivo de fungos comestíveis e medicinais utilizando resíduos da agroindústria vem se apresentando como uma alternativa econômica para o pequeno produtor rural, favorecendo a agricultura familiar do nordeste catarinense. Este trabalho avaliou o fungo Pleurotus para a decomposição lignocelulolítica de palha de folhas de bananeira e a utilização da palha residual como substrato para o cultivo de Agaricus blazei. Ajustes na composição do substrato residual de Pleurotus, tais como o tipo e a concentração da fonte de nitrogênio, a porcentagem de inóculo e a camada de cobertura, foram avaliadas. O substrato residual que mais favoreceu a produção de A. blazei em Eficiência Biológica (6,73%), Rendimento (79,71%) e menor tempo para emissão do primeiro primórdio (27 dias) foi o substrato residual de P. ostreatus inoculado com 20% de inóculo (ms), 10% de farelo de arroz (ms), sem sulfato de amônio e utilizando terra de subsolo como camada de cobertura