Reproductive fluids, used for the in vitro production of pig embryos, result in healthy offspring and avoid aberrant placental expression of PEG3 and LUM

Background: In vitro embryo production (IVP) and embryo transfer (ET) are two very common assisted reproductive technologies (ART) in human and cattle. However, in pig, the combination of either procedures, or even their use separately, is still considered suboptimal due to the low efficiency of IVP plus the difficulty of performing ET in the long and contorted uterus of the sow. In addition, the potential impact of these two ART on the health of the offspring is unknown. We investigated here if the use of a modified IVP system, with natural reproductive fluids (RF) as supplements to the culture media, combined with a minimally invasive surgery to perform ET, affects the output of the own IVP system as well as the reproductive performance of the mother and placental molecular traits. Results: The blastocyst rates obtained by both in vitro systems, conventional (C-IVP) and modified (RF-IVP), were similar. Pregnancy and farrowing rates were also similar. However, when compared to in vivo control (artificial insemination, AI), litter sizes of both IVP groups were lower, while placental efficiency was higher in AI than in RF-IVP. Gene expression studies revealed aberrant expression levels for PEG3 and LUM in placental tissue for C-IVP group when compared to AI, but not for RF-IVP group. Conclusions: The use of reproductive fluids as additives for the culture media in pig IVP does not improve reproductive performance of recipient mothers but could mitigate the impact of artificial procedures in the offspring.MINECO, FEDER, Fundación Senec

Generation of Calpain-3 knock-out porcine embryos by CRISPR-Cas9 electroporation and intracytoplasmic microinjection of oocytes before insemination

Limb girdle muscular dystrophy type R1 (LGMDR1) is an autosomal recessive myopathy described in humans resulting from a deficiency of calpain-3 protein (CAPN3). This disease lacks effective treatment and an appropriate model, so the generation of KO pigs by CRISPR-Cas9 offers a way to better understand disease ethology and to develop novel therapies. Microinjection is the main method described for gene editing by CRISPR-Cas9 in porcine embryo, but electroporation, which allows handling more embryos faster and easier, has also recently been reported. The objective of the current study was to optimize porcine oocyte electroporation to maximize embryo quality and mutation rate in order to efficiently generate LGMDR1 porcine models. We found that the efficiency of generating CAPN3 KO embryos was highest with 4 electroporation pulses and double sgRNA concentration than microinjection. Direct comparison between microinjection and electroporation demonstrated similar rates of embryo development and mutation parameters. The results of our study demonstrate that oocyte electroporation, an easier and faster method than microinjection, is comparable to standard approaches, paving the way for democratization of transgenesis in pigs

Year-Long Phenotypical Study of Calves Derived From Different Assisted-Reproduction Technologies

Assisted reproductive technologies play a major role in the cattle industry. An increase in the use of in vitro-derived embryos is currently being seen around the globe. But the efficiency and quality of the in vitro-derived embryos are substandard when compared to the in vivo production. Different protocols have been designed to overcome this issue, one of those being the use of reproductive fluids as supplementation to embryo culture media. In this study, in vitro-derived calves produced with reproductive fluids added to their embryo production protocol were followed for the first year of life pairwise with their in vivo control, produced by artificial insemination (AI), and their in vitro control, produced with standard supplementation in embryo production. The objective was to assess if any differences could be found in terms of growth and development as well as hematological and biochemical analytes between the different systems. All the analysed variables (physical, hematological, and biochemical) were within physiological range and very similar between calves throughout the entire experiment. However, differences were more evident between calves derived from standard in vitro production and AI. We concluded that the use of reproductive fluids as a supplementation to the embryo culture media results in calves with closer growth and development patterns to those born by AI than the use of bovine serum albumin as supplementation

Évaluation de l’aléa et du risque sismique en Haïti dirigée vers la conception parasismique

Après le séisme qui eut lieu en Haïti le 12 janvier 2010, dont l’épicentre a été localisé non loin de la capitale, Port-au-Prince (25 km en direction sud-est), d’une magnitude Mw 7.0 et à une profondeur de 13 km, le pays s’est retrouvé dans une situation catastrophique et d’extrême pauvreté, avec des graves carences en matière de santé, nutrition, éducation et logement. Les effets du tremblement de terre ont été dévastateurs pour la population : on compte plus de 300.000 morts, presque autant de blessés et 1,3 millions de sans-abri logès dans des campements « provisoires ». Quant aux conséquences matérielles, le séisme a totalement détruit près de 100.000 maisons et endommagé près de 200.000 (source : USGS). Ce tremblement de terre a été le plus fort enregistré dans la zone depuis 1770. De plus le séisme fut perceptible dans des pays voisins comme Cuba, la Jamaïque et la République Dominicaine, où il a provoqué l’alarme et des évacuations préventives. La reconstruction du pays reste un sujet prioritaire pour la coopération internationale. Le présent projet, SISMO-HAITÍ, a été développé dans le but d’apporter la connaissance et l’information nécessaires afin de faciliter la prise de mesures préventives face au risque sismique existant, afin d’éviter qu’un éventuel futur séisme ne déclenche une nouvelle catastrophe. Dans le cas d’Haïti, aucune institution n’était chargée d’assurer une surveillance sismique, mais un contact direct a été établi avec l’Observatoire National de l’Environnement et de la Vulnérabilité (ONEV) en Haïti à travers son directeur Dwinel Belizaire Ing. M. Sc., qui est précisément celui qui a sollicité l’aide qui a motivé la présente proposition. Le but ultime de ce projet est l’étude des mesures d’atténuation du risque élevé qui demeure, contribuant ainsi au développement durable de la région. Dans cette optique, la menace sismique en Haïti a été évaluée, constituant la base sur laquelle on prétend élaborer des critères de conception parasismique pour la reconstruction du pays qui pourront être inclus dans la première version de la norme antisismique, ainsi que le risque sismique à Port-au-Prince, dont les résultats serviront de base pour élaborer les plans d’urgence face à ce risque naturel. Les objectifs spécifiques atteints sont : • Évaluation de l'aléa sismique en Haïti. On en obtient des cartes de différents paramètres de mouvement pour différentes probabilités de dépassement (ce qui suppose connaître la probabilité associée aux mouvements dus à des tremblements futurs). • Évaluation de l'effet local à Port-au-Prince et élaboration d'une carte de microzonage de la ville. • Étude de la vulnérabilité sismique locale à Port-au-Prince. • Estimation du risque sismique à Port-au-Prince. • Mesures d'atténuation du risque et de conception parasismique. Ce rapport résume les activités et les résultats obtenus a cours de l'année 2011 lors de la mise en œuvre de ce projet. Le groupe de travail est une équipe multidisciplinaire composée de chercheurs de différents établissements universitaires et de recherche (Université Polytechnique de Madrid-UPM-, Conseil Supérieur de la Recherche Scientifique (CSIC) ; U. Complutense de Madrid-UCM-, U-UA-Alicante, Almeria-UAL-U., U. Autonome de Saint-Domingue, UASD et Université de Porto Rico Mayagüez--UPRM) experts dans les diverses matières impliquées dans le projet: géologie, sismologie, génie parasismique, architecture et gestion de l'information géographique. Tous les membres de cette équipe ont travaillé ensemble tout au long de l'année, en réalisant des réunions, des ateliers de travail, des vidéoconférences, en plus d'une visite à Port-au-Prince en Juillet 2011 afin de procéder à la première collecte de données

Evaluación de la peligrosidad y el riesgo sísmico en Haití y aplicación al diseño sismorresistente

Tras el terremoto ocurrido en Haití el 12 de enero de 2010, con un epicentro próximo a la capital, Puerto Príncipe (25 km), de magnitud Mw 7,0 y profundidad de 13 km, el país ha quedado en una situación catastrófica y de extrema pobreza, con necesidades básicas de salud, nutrición, educación y habitabilidad. Los efectos del terremoto han sido devastadores en la población, con más de 300.000 personas que han perdido la vida, otras tantas que han resultado heridas y 1,3 millones de personas que han quedado sin hogar y viviendo en campamentos. En cuanto a los efectos materiales, el sismo ha dejado cerca de 100.000 residencias totalmente destruidas y casi 200.000 dañadas fuertemente (fuente: USGS). Este terremoto ha sido el más fuerte registrado en la zona desde el acontecido en 1770. Además, el sismo fue perceptible en países cercanos como Cuba, Jamaica y República Dominicana, donde provocó temor y evacuaciones preventivas. La reconstrucción del país es un tema prioritario en el marco de la cooperación internacional y el presente proyecto, SISMO-HAITÍ, se ha desarrollado con el fin de aportar conocimiento e información para facilitar la toma de medidas preventivas ante el riesgo sísmico existente, tratando de evitar que un terremoto futuro en el país produzca una catástrofe como el recientemente vivido. En el caso de Haití, no existía ninguna institución responsable del monitoreo sísmico, pero se ha establecido contacto directo con el Observatorio Nacional de Medio Ambiente y Vulnerabilidad de Haití (ONEV) a través de su director Dwinel Belizaire Ing. M. Sc. Director, que es precisamente quien ha solicitado la ayuda que ha motivado la presente propuesta. El fin último de este proyecto es el estudio de acciones de mitigación del elevado riesgo existente, contribuyendo al desarrollo sostenible de la región. Para ello, se ha evaluado la amenaza sísmica en Haití, en base a la cual se pretenden establecer criterios de diseño sismorresistente para la reconstrucción del país, que se podrán recoger en la primera normativa antisísmica, así como el riesgo sísmico en Puerto Príncipe, cuyos resultados servirán de base para elaborar los planes de emergencia ante este riesgo natural. Los objetivos específicos alcanzados son: • Evaluación de amenaza sísmica en Haití, resultando mapas de distintos parámetros de movimiento para diferentes probabilidades de excedencia (lo que supone conocer la probabilidad asociada a movimientos por futuros terremotos). • Evaluación del efecto local en Puerto Príncipe y elaboración de un mapa de microzonación de la ciudad. • Estudio de vulnerabilidad sísmica a escala local en Puerto Príncipe • Estimación del riesgo sísmico en Puerto Príncipe • Medidas de mitigación del riesgo y de diseño sismorresistente En este informe se resumen las actividades desarrolladas y los resultados obtenidos a lo largo del año 2011 durante la ejecución del presente proyecto. El grupo de trabajo es un equipo multidisciplinar, compuesto por investigadores de diferentes universidades (Universidad Politécnica de Madrid- UPM-, U. Complutense de Madrid -UCM-, U. Alicante -UA-, U. Almería -UAL-, U. Autónoma de Santo Domingo -UASD- y U. de Mayagüez de Puerto Rico -UPRM-) que cubren todas las ramas involucradas en la ejecución del proyecto: geología, sismología, ingeniería sísmica, arquitectura y gestión de geoinformación. Todos los miembros de este equipo han trabajado conjuntamente durante todo el año, manteniendo reuniones, jornadas de trabajo y videoconferencias, además de realizar una visita a Puerto Príncipe en julio de 2011 para llevar a cabo la primera toma de datos

SISMO-HAITÍ: Proyecto de cooperación para el cálculo de la peligrosidad y el riesgo sísmico en Haití

El terremoto ocurrido el 12 de enero de 2010 en Haití devastó la ciudad de Puerto Príncipe, interrumpiendo la actividad social y económica. El proyecto Sismo-Haití surgió como respuesta a la solicitud de ayuda del país ante esta catástrofe y está siendo llevado a cabo por el grupo de investigación en Ingeniería Sísmica de la Universidad Politécnica de Madrid, especialistas en geología y sismología de las universidades Complutense de Madrid, Almería y Alicante, el Consejo Superior de investigaciones Científicas y técnicos locales Haitianos. En el marco del citado proyecto se realizará un estudio de la amenaza sísmica, con la consiguiente obtención de mapas de aceleraciones que sirvan de base para una primera normativa sismorresistente en el país. Asimismo, se llevará a cabo un estudio de riesgo sísmico en alguna población piloto, incluyendo estudios de microzonación y vulnerabilidad sísmica, así como la estimación de daños y pérdidas humanas ante posibles sismos futuros, cuyos resultados irán dirigidos al diseño de planes de emergencia. En este trabajo se presentan los primeros avances del proyecto. Uno de los objetivos más importantes del proyecto Sismo-Haití es la formación de técnicos en el país a través de la transmisión de conocimientos y experiencia que el grupo de trabajo tiene en materia de peligrosidad y riesgo sísmico, así como en todo lo relacionado con la gestión de la emergencia

Spatiotemporal Characteristics of the Largest HIV-1 CRF02_AG Outbreak in Spain: Evidence for Onward Transmissions

Background and Aim: The circulating recombinant form 02_AG (CRF02_AG) is the predominant clade among the human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) non-Bs with a prevalence of 5.97% (95% Confidence Interval-CI: 5.41–6.57%) across Spain. Our aim was to estimate the levels of regional clustering for CRF02_AG and the spatiotemporal characteristics of the largest CRF02_AG subepidemic in Spain.Methods: We studied 396 CRF02_AG sequences obtained from HIV-1 diagnosed patients during 2000–2014 from 10 autonomous communities of Spain. Phylogenetic analysis was performed on the 391 CRF02_AG sequences along with all globally sampled CRF02_AG sequences (N = 3,302) as references. Phylodynamic and phylogeographic analysis was performed to the largest CRF02_AG monophyletic cluster by a Bayesian method in BEAST v1.8.0 and by reconstructing ancestral states using the criterion of parsimony in Mesquite v3.4, respectively.Results: The HIV-1 CRF02_AG prevalence differed across Spanish autonomous communities we sampled from (p < 0.001). Phylogenetic analysis revealed that 52.7% of the CRF02_AG sequences formed 56 monophyletic clusters, with a range of 2–79 sequences. The CRF02_AG regional dispersal differed across Spain (p = 0.003), as suggested by monophyletic clustering. For the largest monophyletic cluster (subepidemic) (N = 79), 49.4% of the clustered sequences originated from Madrid, while most sequences (51.9%) had been obtained from men having sex with men (MSM). Molecular clock analysis suggested that the origin (tMRCA) of the CRF02_AG subepidemic was in 2002 (median estimate; 95% Highest Posterior Density-HPD interval: 1999–2004). Additionally, we found significant clustering within the CRF02_AG subepidemic according to the ethnic origin.Conclusion: CRF02_AG has been introduced as a result of multiple introductions in Spain, following regional dispersal in several cases. We showed that CRF02_AG transmissions were mostly due to regional dispersal in Spain. The hot-spot for the largest CRF02_AG regional subepidemic in Spain was in Madrid associated with MSM transmission risk group. The existence of subepidemics suggest that several spillovers occurred from Madrid to other areas. CRF02_AG sequences from Hispanics were clustered in a separate subclade suggesting no linkage between the local and Hispanic subepidemics

Generación de cerdos modificados genéticamente mediante CRISPR-Cas9 como modelos experimentales

La edición génica consiste en la modificación de la secuencia de ADN. El desarrollo de endonucleasas programables ha supuesto un importante avance en la eficiencia de la edición génica. El uso de esta tecnología se encuentra ampliamente desarrollada, presentando diversas aplicaciones como: ciencia básica, mejora en la producción ganadera y aplicaciones biomédicas. El cerdo (Sus scrofa domesticus) es uno de los animales más importantes en la industria cárnica a nivel mundial. La producción de embriones in vitro en esta especie es aún ineficiente debido a la alta poliespermia y un desarrollo embrionario subóptimo. Por esto, uno de los principales objetivos fue optimizar las condiciones para la generación de embriones de cerdo knock-out (KO) mediante diferentes metodologías para maximizar la eficiencia del sistema, en términos de desarrollo embrionario y mutación. Por otro lado, la producción de embriones editados genéticamente tiene una importante limitación, el mosaicismo, siendo así otro objetivo central de este estudio producir embriones con la menor incidencia de mosaicismo para posteriormente obtener cerdos con la mutación deseada. Todos los estudios mostrados en esta Tesis Doctoral se basaron en el uso de un sistema convencional de producción de embriones in vitro (PIV) que implica la maduración de complejos cúmulo-ovocito (COC) y la fecundación in vitro (FIV), seguida de cultivo embrionario. En este trabajo experimental, semen de verraco congelado-descongelado se usa para la FIV después de ser seleccionado mediante swim-up, que también se había optimizado previamente. La detección de mutaciones se realizó mediante PCR con cebadores fluorescentes seguida de una electroforesis capilar. Las muestras se consideraron nativas cuando el pico obtenido por electroforesis capilar fue del mismo tamaño que el pico de control. Otros picos se consideraron KO, y cuando se detectaron más de dos picos, se evaluó como mosaico. En el capítulo 2 se evaluó el tiempo de microinyección y el uso de Cas9 como ARN o ribonucleoproteína (RNP). Cuando Cas9 se administró como ARNm, la tasa de mutación fue similar en todos los grupos (30-42%), mientras que la tasa de mosaicismo fue de 0-21%. Por otro lado, con RNP, las tasas de mutación no difirieron entre los grupos, pero fueron más altas en comparación con Cas9-mARN. La tasa de mosaicismo fue menor en el grupo microinyectado antes de la inseminación (15%) en comparación con los inyectados después (33-57%). Por lo tanto, los embriones microinyectados con RNP antes de la inseminación seguida de la transferencia de embriones permitieron la producción de dos hembras y un macho con mutaciones en ambos alelos del gen TPC2. En el capítulo 3, después de la optimización de las condiciones de electroporación y en la proporción de sgRNA:Cas9, se probó la eficiencia de la electroporación frente a la microinyección para analizar diferentes estrategias para generar embriones CAPN3-KO que podrían ser modelos de LGMDR1. En cuanto a los parámetros de mutación y tasa de blastocistos, no se encontraron diferencias entre los métodos (electroporación vs. microinyección) ni la combinación de guías. En el último capítulo, el objetivo fue evaluar si la aplicación de afidicolina permite mejorar el sistema de edición de genes reduciendo el mosaicismo sin afectar la calidad-cantidad de embriones genéticamente modificados obtenidos. Para ello se utilizaron sgRNAs contra TPCN1. Como resultado, se observó un efecto positivo al evitar el mosaicismo y un efecto negativo en el desarrollo embrionario. Por lo tanto, bajo las condiciones probadas en estos experimentos, el uso de afidicolina no mostró ninguna ventaja. En conclusión, tras los estudios realizados en los diferentes capítulos de esta Tesis, se ha establecido un sistema eficiente y optimizado para generar embriones y cerdos editados genéticamente que podrían utilizarse para modelos de enfermedades humanas.Gene editing consists of the modification of the genomic sequence. The development of programmable endonucleases supposed an important advance in the efficiency of gene editing. The use of this technology is widely developed and has different applications such as basic science, improving agricultural production, or biomedicine applications. The pig (Sus scrofa domesticus) is one of the most important animals in the meat industry worldwide. The in vitro embryo production in this species is still inefficient due to the high incidence of polyspermic and suboptimal embryo development, being this an important limitation. For this reason, one of the main objectives of this Thesis was to optimize the conditions for the generation of knock-out (KO) pig embryos by different methodologies to achieve the higher efficiency of the system, in terms of blastocyst formation and mutation rates. On the other hand, the production of gene-edited embryos has an important limitation, the incidence of mosaicism, thus being another central objective of this study to produce embryos with the lowest mosaicism incidence to later obtain pigs with the desired mutation and maximum efficiency. All the studies shown in this Doctoral Thesis were based on the use of a conventional system of in vitro embryo production (IVP) involving the use of immature cumulus-oocyte complexes (COCs) and the in vitro fertilization (IVF), followed by an embryo culture procedure. In this experimental work, frozen-thawed boar semen is routinely used for IVF after being selected by a swim-up procedure that had been previously optimized too. Mutation detection was performed using the fluorescent PCR-capillary gel electrophoresis technique. Samples were considered wild type when the peak obtained by capillary electrophoresis was the same size as control peak. Other peaks were considered to be KO, and when more than two peaks were detected, this sample was evaluated as a mosaic. In chapter 2 the time of microinjection and the use of Cas9 as RNA or ribonucleoprotein (RNP) were evaluated. When Cas9 was delivered as mRNA, mutation rate was similar in all groups, being around 30-42%, whereas the mosaicism rate was between 0-21%. On the other hand, when RNP was delivered, mutation rates did not differ between groups but were higher compared with those microinjected with Cas9-mRNA. Mosaicism rate was lower in the group microinjected before insemination (15%) compared with those injected afterwards (33-57%). Therefore, in vitro-produced embryos microinjected with RNP before insemination followed by embryo transfer allowed the production of two females and one male with frame shift mutations in both alleles of the TPC2 gene. In chapter 3, after the optimization of electroporation conditions and changes to the ratio of sgRNA:Cas9, the efficiency of electroporation was tested in comparison to microinjection to analyse different strategies to generate CAPN3 KO pig embryo that could be models of LGMDR1 human disease. Regarding mutation parameters and blastocyst rate, no differences were found between either the methods (electroporation vs. microinjection) or the combination of guides. In the last chapter, the objective was to evaluate whether the application of aphidicolin makes it possible to improve the gene-editing system by reducing the mosaicism without affecting the quality and quantity of genetically modified embryos obtained. For this, sgRNAs against TPCN1 were used. As a result, a positive effect in avoiding the mosaicism and a negative effect of aphidicolin were observed in blastocyst development was observed. Therefore, under the tested conditions in these experiments, the use of aphidicolin did not show any advantage. In conclusion, after the studies carried out in the different chapters of this Thesis, an efficient and optimized system has been established to generate gene-edited embryos and pigs that could be used for human disease models

Production of Genetically Modified Porcine Embryos via Lipofection of Zona-Pellucida-Intact Oocytes Using the CRISPR/Cas9 System

Genetically modified pigs are very useful thanks to their applications in basic research, biomedicine, and meat production. There are different methods for producing them, including cloning and the microinjection or electroporation of oocytes and zygotes. Easier techniques are being developed, such as lipofection, which involves the encapsulation of the CRISPR/Cas9 system into vesicles that are introduced into cells. We compared the embryo development and mutation rates associated with different conditions of lipofection treatment with the electroporation technique in zona-pellucida-intact porcine oocytes. We found that the lipofection treatment, once optimized, was as effective as the electroporation technique in terms of the embryo development and mutation rates. In addition, an increment in the concentration in the media of the liposomes-CRISPR/Cas9 system complexes had a detrimental effect on the embryo development parameters, which could indicate a possible toxic effect. The achievement of generating mutant embryos via lipofection without removing the zona pellucida could open up a new, easy, and cheap way of producing genetically modified pigs.The generation of genetically modified pigs has an important impact thanks its applications in basic research, biomedicine, and meat production. Cloning was the first technique used for this production, although easier and cheaper methods were developed, such as the microinjection, electroporation, or lipofection of oocytes and zygotes. In this study, we analyzed the production of genetically modified embryos via lipofection of zona-pellucida-intact oocytes using Lipofectamine (TM) CRISPRMAX (TM) Cas9 in comparison with the electroporation method. Two factors were evaluated: (i) the increment in the concentration of the lipofectamine-ribonucleoprotein complexes (LRNPC) (5% vs. 10%) and (ii) the concentration of ribonucleoprotein within the complexes (1xRNP vs. 2xRNP). We found that the increment in the concentration of the LRNPC had a detrimental effect on embryo development and a subsequent effect on the number of mutant embryos. The 5% group had a similar mutant blastocyst rate to the electroporation method (5.52% and 6.38%, respectively, p > 0.05). The increment in the concentration of the ribonucleoprotein inside the complexes had no effect on the blastocyst rate and mutation rate, with the mutant blastocyst rate being similar in both the 1xRNP and 2xRNP lipofection groups and the electroporation group (1.75%, 3.60%, and 3.57%, respectively, p > 0.05). Here, we showed that it is possible to produce knock-out embryos via lipofection of zona-pellucida-intact porcine oocytes with similar efficiencies as with electroporation, although more optimization is needed, mainly in terms of the use of more efficient vesicles for encapsulation with different compositions

Production of Genetically Modified Porcine Embryos via Lipofection of Zona-Pellucida-Intact Oocytes Using the CRISPR/Cas9 System

The generation of genetically modified pigs has an important impact thanks its applications in basic research, biomedicine, and meat production. Cloning was the first technique used for this production, although easier and cheaper methods were developed, such as the microinjection, electroporation, or lipofection of oocytes and zygotes. In this study, we analyzed the production of genetically modified embryos via lipofection of zona-pellucida-intact oocytes using LipofectamineTM CRISPRMAXTM Cas9 in comparison with the electroporation method. Two factors were evaluated: (i) the increment in the concentration of the lipofectamine–ribonucleoprotein complexes (LRNPC) (5% vs. 10%) and (ii) the concentration of ribonucleoprotein within the complexes (1xRNP vs. 2xRNP). We found that the increment in the concentration of the LRNPC had a detrimental effect on embryo development and a subsequent effect on the number of mutant embryos. The 5% group had a similar mutant blastocyst rate to the electroporation method (5.52% and 6.38%, respectively, p > 0.05). The increment in the concentration of the ribonucleoprotein inside the complexes had no effect on the blastocyst rate and mutation rate, with the mutant blastocyst rate being similar in both the 1xRNP and 2xRNP lipofection groups and the electroporation group (1.75%, 3.60%, and 3.57%, respectively, p > 0.05). Here, we showed that it is possible to produce knock-out embryos via lipofection of zona-pellucida-intact porcine oocytes with similar efficiencies as with electroporation, although more optimization is needed, mainly in terms of the use of more efficient vesicles for encapsulation with different compositions