Characterization of the expression of transcriptionally silent loci during the plant response against Pseudomonas syringae

Pseudomonas syringae es una bacteria en forma de bacilo, Gram-negativa, hemibiotrófa y con flagelos polares, que provoca una amplia variedad de síntomas en plantas, incluyendo manchas necróticas y/o cloróticas foliares y agallas. Pseudomonas syringae sobrevive en las superficies de las hojas como una epífita, antes de entrar en el espacio intercelular a través de aberturas naturales como estomas o heridas, para iniciar el proceso de infección (Hirano and Upper, 2000). P. syringae pv. tomato (en adelante Pto) DC3000, la principal estirpe modelo para el estudio de la interacción de P. syringae con el huésped, es el agente causante de la mancha bacteriana en tomate, y también puede causar enfermedad en la planta modelo Arabidopsis thaliana. Pto posee un sistema de secreción tipo III (T3SS) que es esencial para su patogénesis. El T3SS es un complejo aparato de secreción compuesto de aproximadamente 30 proteínas diferentes. Este sofisticado aparato acopla la secreción de proteínas denominadas efectores,a través de las membranas interna y externa de la bacteria,con la translocación a través de las membranas citoplasmáticas eucariotas, así como a través de la pared celular en el caso del T3SS de bacterias patógenas de plantas (Nguyen et al., 2000). Estudios recientes de la interacción planta-huésped han demostrado que las bacterias fitopatógenas modifican el epigenoma del huésped y que las plantas han desarrollado defensas específicas contra la supresión del silenciamiento transcripcional, orquestada por agentes patógenos. Estos estudios sugieren que la metilación de DNA dirigida por RNA (RdDM) y el silenciamiento génico transcripcional juegan un papel importante en la interacción planta-huésped (Pumplin and Voinnet, 2013). El objetivo de esta Tesis Doctoral ha sido profundizar en el conocimiento de la interacción planta-huésped a nivel epigenético. Para ello se han analizado los cambios que se producen en el estado de metilación del genoma de Arabidopsis y en la activación de loci silenciados transcripcionalmente durante la infección por Pto. Se ha caracterizado la importancia de los determinantes de virulencia de P. syringae y de los distintos mecanismos de defensa en la activación de los loci silenciados transcripcionalmente. Además se ha profundizado en la importancia que tienen los procesos de metilación y desmetilación del DNA en la respuesta de defensa de Arabidopsis frente a P. syringae. Hirano, S.S. and Upper, C.D. (2000) Bacteria in the leaf ecosystem with emphasis on Pseudomonas syringae - A pathogen, ice nucleus, and epiphyte. Microbiology and Molecular Biology Reviews 64, 624-653. Nguyen, L., Paulsen, I.T., Tchieu, J., Hueck, C.J. and Saier Jr, M.H. (2000) Phylogenetic analyses of the constituents of Type III protein secretion systems. Journal of Molecular Microbiology and Biotechnology 2, 125-144. Pumplin, N. and Voinnet, O. (2013) RNA silencing suppression by plant pathogens: defence, counter-defence and counter-counter-defence. Nature Reviews Microbiology 11, 745-760

Characterization of Enterococcal Community Isolated from an Artisan Istrian Raw Milk Cheese: Biotechnological and Safety Aspects

U ovom su radu istraženi prevalencija, biotehnološki i sigurnosni profil 588 izolata enterokoka prikupljenih iz uzoraka sirovog mlijeka te istarskog sira tijekom zrenja. Unatoč sporadičnoj i varijabilnoj prisutnosti enterokoka u mlijeku ((3,65±2,93) log CFU/mL), nakon 30 dana sazrijevanja sira broj enterokoka je usporedivo visok ((7,96±0.80)) log CFU/g), što potvrđuje da su enterokoki sastavni dio temeljne mikrobiote istarskog sira. Dominantne vrste enterokoka identificirane su kao E. faecium (53,8 %) i E. faecalis (42,4 %), dok su vrste E. durans (2,84 %) i E. casseliflavus (0,95 %) bile zastupljene u manjem broju. Na temelju analize obrazaca metoda otiska prsta (RAPD-PCR), ustanovljena je i velika varijabilnost unutar vrste te detektirano 35 sojeva (genotipova). Većina sojeva bila je specifična za određenu farmu, dok je jedna trećina genotipova detektirana u uzorcima svih šest istraživanih farmi. Ova varijabilnost sojeva odraz je razlika u tehnologiji proizvodnje istarskog sira na različitim farmama, kao što su: različita koncentracija soli, temperatura i relativna vlažnost zraka tijekom zrenja sira, te mikroklimatski ili vegetacijski uvjeti. Među sojevima iste vrste utvrđena je znatna varijabilnost u pogledu biotehnoloških karakteristika, kao i značajne razlike u sposobnosti preživljavanja u simuliranim gastrointestinalnim uvjetima. Znatan broj sojeva bio je otporan na klinički važne antibiotike, kao što su tetraciklin (43,56 %), eritromicin (35,79 %) i vankomicin (23,48 %). Analizom lančane reakcije polimerazom (PCR) nije detektirana niti jedna od genskih determinanti za otpornost na vankomicin i eritromicin; za tetraciklin je detektiran gen tetM.In this study, prevalence, biotechnological and safety profiles of 588 Enterococcus isolates isolated from raw milk and Istrian cheese during different stages of ripening were analyzed. Despite the low and variable presence of enterococci in milk ((3.65±2.93) log CFU/mL), highly comparable enterococcal populations were established after 30 days of cheese ripening ((7.96±0.80) log CFU/g), confirming Enterococcus spp. as a major part of the core microbiota of Istrian cheese. The dominant species were E. faecium (53.8 %) and E. faecalis (42.4 %), while minor groups, consisting of E. durans (2.84 %) and E. casseliflavus (0.95 %), also occurred. A pronounced intraspecies variability was noticed based on molecular fingerprinting, with 35 strains (genotypes) detected. Most of the genotypes were farm-specific with one third being shared between the farms. This genotype variability reflected particular differences of Istrian cheese production, mainly variable salt concentration, ripening temperature and air humidity as well as microclimatic or vegetation conditions. There was considerable variation between the strains of the same species regarding wide range of biotechnologically important traits as well as their ability to survive in simulated gastrointestinal conditions. A considerable number of strains were resistant to critically important antibiotics such as tetracycline (43.56 %), erythromycin (35.79 %) and vancomycin (23.48 %). Polymerase chain reaction-based detection did not identify any of the common genetic determinants for vancomycin and erythromycin resistance; for tetracycline tetM gene was detected. The presence of virulence genes including agg, efaAfs, gelE, cylM, cylB, cylA, esp, efaAfm, cob and cpd was frequently recorded, especially among E. faecalis strains