A general framework for optimization of probes for gene expression microarray and its application to the fungus Podospora anserina

<p>Abstract</p> <p>Background</p> <p>The development of new microarray technologies makes custom long oligonucleotide arrays affordable for many experimental applications, notably gene expression analyses. Reliable results depend on probe design quality and selection. Probe design strategy should cope with the limited accuracy of <it>de novo </it>gene prediction programs, and annotation up-dating. We present a novel <it>in silico </it>procedure which addresses these issues and includes experimental screening, as an empirical approach is the best strategy to identify optimal probes in the <it>in silico </it>outcome.</p> <p>Findings</p> <p>We used four criteria for <it>in silico </it>probe selection: cross-hybridization, hairpin stability, probe location relative to coding sequence end and intron position. This latter criterion is critical when exon-intron gene structure predictions for intron-rich genes are inaccurate. For each coding sequence (CDS), we selected a sub-set of four probes. These probes were included in a test microarray, which was used to evaluate the hybridization behavior of each probe. The best probe for each CDS was selected according to three experimental criteria: signal-to-noise ratio, signal reproducibility, and representative signal intensities. This procedure was applied for the development of a gene expression Agilent platform for the filamentous fungus <it>Podospora anserina </it>and the selection of a single 60-mer probe for each of the 10,556 <it>P. anserina </it>CDS.</p> <p>Conclusions</p> <p>A reliable gene expression microarray version based on the Agilent 44K platform was developed with four spot replicates of each probe to increase statistical significance of analysis.</p

Global Analysis of Extracytoplasmic Stress Signaling in Escherichia coli

The Bae, Cpx, Psp, Rcs, and σE pathways constitute the Escherichia coli signaling systems that detect and respond to alterations of the bacterial envelope. Contributions of these systems to stress response have previously been examined individually; however, the possible interconnections between these pathways are unknown. Here we investigate the dynamics between the five stress response pathways by determining the specificities of each system with respect to signal-inducing conditions, and monitoring global transcriptional changes in response to transient overexpression of each of the effectors. Our studies show that different extracytoplasmic stress conditions elicit a combined response of these pathways. Involvement of the five pathways in the various tested stress conditions is explained by our unexpected finding that transcriptional responses induced by the individual systems show little overlap. The extracytoplasmic stress signaling pathways in E. coli thus regulate mainly complementary functions whose discrete contributions are integrated to mount the full adaptive response

Bioinformatique des puces à ADN et application à l\u27analyse du transcriptome de Buchnera aphidicola

L\u27objectif de cette thèse est l\u27étude par la technologie des puces à ADN, du transcriptome de la bactérie Buchnera aphidicola, qui vit en symbiose avec le puceron du pois Acyrthosiphon pisum. Le génome extrêmement réduit de Buchnera a perdu l\u27essentiel de ses gènes de régulation, mais conserve les voies de biosynthèse permettant la production des acides aminés essentiels pour son hôte. La première partie de cette thèse concerne le développement du logiciel ROSO, qui permet de déterminer les sondes oligo-nucléotidiques destinées aux puces. Une interface a été conçue pour son utilisation en ligne (http://pbil.univ-lyon1.fr/roso). Dans une seconde partie, la conception et l\u27utilisation d\u27une puce dédiée à Buchnera ont permis d\u27étudier le transcriptome de la bacté-rie, lorsque son hôte subit un stress nutritionnel et osmotique. Cette analyse montre que Buchnera est capable de réguler son ex-pression génique et de réorienter son métabolisme, pour répondre à la demande changeante de son hôte

Bioinformatique des puces à ADN et application à l'analyse du transcriptome de Buchnera aphidicola

The aim of this thesis is the study of the transcriptome of the bacterium Buchnera aphidicola, the primary endosymbiont of the pea aphid, Acyrthosiphon pisum, by microarray technology. The high interdependance between Buchnera and the aphid caused modifications of the bacterial genome, including loss of most regulatory genes. However, Buchnera retained the biosynthesis pathways, for the production of essential amino acids to its host. The first part of this thesis relates to the development of ROSO, a software to design optimized oligonucleotide probes for microarrays. An interface was conceived to allow its use on line (http://pbil.univ-lyon1.fr/roso). In the second part, the design and the use of a chip dedicated to Buchnera allowed to study the bacterial transcriptome, under nutritionnal and osmotic stress in the diet of the aphid. This analysis shows that Buchnera is able to modify its gene expression and to adapt its metabolism to answer to changing demand of its host.L'objectif de cette thèse est l'étude par la technologie des puces à ADN, du transcriptome de la bactérie Buchnera aphidicola, qui vit en symbiose avec le puceron du pois Acyrthosiphon pisum. Le génome extrêmement réduit de Buchnera a perdu l'essentiel de ses gènes de régulation, mais conserve les voies de biosynthèse permettant la production des acides aminés essentiels pour son hôte. La première partie de cette thèse concerne le développement du logiciel ROSO, qui permet de déterminer les sondes oligonucléotidiques destinées aux puces. Une interface a été conçue pour son utilisation en ligne (http://pbil.univ-lyon1.fr/roso). Dans une seconde partie, la conception et l'utilisation d'une puce dédiée à Buchnera ont permis d'étudier le transcriptome de la bactérie, lorsque son hôte subit un stress nutritionnel et osmotique. Cette analyse montre que Buchnera est capable de réguler son expression génique et de réorienter son métabolisme, pour répondre à la demande changeante de son hôte

Bioinformatique des puces à ADN et application à l'analyse du transcriptome de Buchnera aphidicola

L objectif de cette thèse est l étude par la technologie des puces à ADN, du transcriptome de la bactérie Buchnera aphidicola, qui vit en symbiose avec le puceron du pois Acyrthosiphon pisum. Le génome extrêmement réduit de Buchnera a perdu l essentiel de ses gènes de régulation, mais conserve les voies de biosynthèse permettant la production des acides aminés essentiels pour son hôte. La première partie de cette thèse concerne le développement du logiciel ROSO, qui permet de déterminer les sondes oligo-nucléotidiques destinées aux puces. Une interface a été conçue pour son utilisation en ligne (http://pbil.univ-lyon1.fr/roso). Dans une seconde partie, la conception et l utilisation d une puce dédiée à Buchnera ont permis d étudier le transcriptome de la bacté-rie, lorsque son hôte subit un stress nutritionnel et osmotique. Cette analyse montre que Buchnera est capable de réguler son ex-pression génique et de réorienter son métabolisme, pour répondre à la demande changeante de son hôte.The aim of this thesis is the study of the transcriptome of the bacterium Buchnera aphidicola, the primary endosymbiont of the pea aphid, Acyrthosiphon pi-sum, by microarray technology. The high interdependance between Buchnera and the aphid caused modifications of the bacterial genome, including loss of most regulatory genes. However, Buchnera retained the biosynthesis pathways, for the production of essential amino acids to its host. The first part of this the-sis relates to the development of ROSO, a software to design optimized oligonucleotide probes for microarrays. An interface was conceived to allow its use on line (http://pbil.univ-lyon1.fr/roso). In the second part, the design and the use of a chip dedicated to Buchnera allowed to study the bacterial transcrip-tome, under nutritionnal and osmotic stress in the diet of the aphid. This analysis shows that Buchnera is able to modify its gene expression and to adapt its metabolism to answer to changing demand of its host.VILLEURBANNE-DOC'INSA LYON (692662301) / SudocSudocFranceF

Les données d’expression

International audienc

Les données d’expression

International audienc

ROSO : un logiciel de recherche et d'optimisation des sondes oligonucléotidiques destinées aux puces à ADN

International audienceFace à l’augmentation exponentielle des données issues du séquençage complet de nombreux organismes, les puces à ADN représentent un formidable outil d’analyse et de modélisation du fonctionnement des génomes. Leur utilisation nécessite une analyse bioinformatique préliminaire des gènes à étudier. Cela nous a incité à développer ROSO, un logiciel de choix des oligonucléotides déposés sur les puces à ADN. ROSO offre à l’utilisateur la possibilité de choisir la taille et le type des sondes, les concentrations en cible et en ions de la solution de dépôt, un intervalle pour la température d’hybridation, les seuils de rejet de formation des structures secondaires et la localisation des sondes sur les gènes étudiés. La démarche d’optimisation est basée sur quatre critères de sélection. Le premier est la spécificité des oligonucléotides par rapport à l’ensemble des gènes étudiés, mais aussi par rapport à l’ensemble des gènes pour lesquels l’utilisateur veut éviter un phénomène d’hybridation croisée. Cette spécificité est testée avec le programme Blast, paramétré de façon à conserver toutes les homologies de l'ordre de 70 % sur une longueur minimale de 20 bases. A l'issu de cette analyse, ROSO permet de définir des zones avec des taux d’homologie variant entre 60 % (zone spécifique) et 100 % (zone parfaitement homologue). Le second critère est l’absence de formation de structures secondaires (épingles à cheveux et homoduplex). ROSO choisit des sondes dépourvues de telles structures dans des zones d'homologie minimale. Le troisième critère est la température de fusion (Tm) qui est calculée à l’aide du modèle thermodynamique dit du plus proche voisin. ROSO retient des sondes ayant le plus petit écart de Tm possible. Enfin le logiciel choisit pour chaque gène, la meilleure sonde possible en fonction de la localisation (intervalle de n bases situé à l’une ou à l’autre des extrémités) et de différents critères de stabilité (taux de GC, ancrage GC…). Par ailleurs, il offre la possibilité de calculer le Tm de sondes de contrôle présentant des mésappariements. L'originalité de notre démarche d’optimisation réside dans la prise en compte simultanée de plusieurs critères d'optimisation (Tm, structures secondaires, position de la sonde sur le gène, et taux d'homologie) par requêtes successives. L'utilisateur dispose ainsi pour les gènes "à problème", de plusieurs sondes accordant des importances variables à ces différents critères. Plusieurs types de validations ont été réalisées. D’une part avec des jeux de données artificiels qui ont permis une comparaison des résultats de ROSO avec les logiciels de référence Oligo6® et Mfold. La qualité de sondes de 15 a 70 bases possédant des taux d’homologie compris entre 30 a 70 % est équivalente. Et d’autre part avec le choix de sondes oligonucléotidiques pour des génomes bactériens (Buchnera aphidicola et Ralstonia solanacearum), mais aussi humain et murin. Ce travail est réalisé en collaboration avec l’UMR 55583 (UCB Lyon), et dans le cadre de la Génopôle Rhône-Alpes4. Il devra aboutir à la mise à disposition sur le web d’un logiciel d’utilisation facile et adaptable aux problèmes spécifiques de chaque utilisateur

Développement d'un logiciel d'optimisation de sondes oligonucléotidiques destinées aux puces à ADN

National audienceLes pucerons d’importance économique appartiennent presque tous à la famille des Aphididae (Hemiptera: Aphidoidea: Aphididae), et vivent tous en symbiose avec une bactérie intracellulaire, Entérobactériacée du genre Buchnera, proche d’Escherichia coli. Cette bactérie symbiotique est transmise par voie maternelle. L’association Buchnera / puceron est très ancienne (environ 250 M d’années) et elle est devenue obligatoire pour les deux partenaires : les pucerons rendus expérimentalement aposymbiotiques montrent une fécondité nulle et Buchnera ne semble pas cultivable in vitro. L’intervention de Buchnera dans la physiologie de son hôte a été très étudiée au laboratoire notamment pour ce qui concerne le métabolisme des acides aminés. Il a été montré que la bactérie est capable de fournir la totalité des acides aminés nécessaires au puceron lorsque ceux-ci sont absents de son alimentation à partir de quelques précurseurs glucidiques ou de quelques acides aminés.Buchnera aphidicola, caractérisée depuis le début des années 90, est actuellement le modèle de bactéries endosymbiotiques le mieux connu au niveau moléculaire. Son génome, d’une taille de 640 kb est extrêmement réduit par rapport aux génomes des autres Entérobactériacées non-symbiotiques (4-5 Mb) ; il est à ce jour complètement séquencé pour le symbiote du puceron du pois Acyrthosiphon pisum. Une des caractéristiques fonctionnelles de ce génome est la conservation de la plupart des voies de biosynthèse des acides aminés (contrairement aux parasites intracellulaires qui deviennent souvent auxotrophes pour certains acides aminés). L’organisation de certaines de ces voies est très originale par rapport à celle observée chez E. coli, pourtant très proche phylogénétiquement.Jusqu’au séquençage complet de Buchnera, l’analyse expérimentale des réponses métaboliques et moléculaires ne pouvait s'effectuer que “ voie par voie ”. Le développement de nouveaux outils d’analyse moléculaire (notamment les puces à ADN) et la taille réduite du génome de Buchnera (583 ORF) parfaitement adaptée à la mise en œuvre de puces de moyenne densité, offrent la possibilité d’explorer globalement l'ensemble des réponses métaboliques de cet organisme. Une telle approche devrait permettre une vision intégrée de la fonction anabolique symbiotique : inductions de flux de transports, de patterns globaux de régulation, de phases métaboliques du symbiote (eg bactériomes maternel et embryonnaire).Dans cette perspective, nous développons une collaboration avec des collègues du laboratoire IFOS1 de l'ECL et des collègues du DETAMB2 de l'Université Claude Bernard afin de réaliser une puce à ADN dédiée à l'étude du transcriptome de Buchnera aphidicola

ROSO : un logiciel de recherche et d'optimisation des sondes oligonucléotidiques

International audienc