Gene expression of FOXP3, indoleamine 2,3-dioxygenase (IDO), IL10 and CSF1 in the uterus of cows that received an intrauterine infusion of maternal and paternal antigens

Sensitization with conceptus antigens has been shown to be useful for improving reproductive performance facilitating maternal acceptance of an allogeneic embryo through the induction of cytokines and immunoregulatory cells in the uterine microenvironment. As FOXP3, IDO, IL10 and CSF1 in the uterus are important on the recognition and development of embryos during early pregnancy, this study aimed to determine whether simultaneous or isolated administration of paternal (semen) and maternal (PBMCs) antigens in the uterus of cow, on the day of estrus, influence the gene expression of these cytokines. Forty crossbred cows were divided into four treatments: T0: Control; T1: Semen; T2: PBMCs (peripheral blood mononuclear cells) from another cow and T3: PBMCs+Semen. Antigens were administered into the uterine body on the estrus day (D0). Uterine biopsies designed for molecular analysis of gene expression were collected in vivo seven (D7) and fourteen (D14) days after immunostimulation. Transcripts from FOXP3, IDO, IL-10 and CSF-1 were detected in all RNA samples extracted from uterine biopsies. The semiquantitative analysis showed that none of the treatments caused significant increase in the expression of these genes. Furthermore, on D14 all treatments led to a decline in the number of CSF-1 transcripts; moreover, treatment with PBMCs+Semen also led to a drop in the abundance of IL-10 transcripts. Such results suggest that isolated or simultaneous administration of both antigens would not increase maternal tolerance to embryo alloantigens, nor would it create favorable conditions to its growth and pre-implantation development, at least regarding the effects mediated by these genes on D7 and D14 of the estrous cycle

Padrão de metilação da DMR do último éxon do gene IGF2 em ovócitos e células do cumulus de vacas nelore

Assisted reproductive biotechnologies are essential instrument for the modern cattle breeding. In vitro embryo production (IVP) is prominence, situating Brazil as a country that more produce and transfer in vitro embryos in the word. In spite of the IVP big capacity to produce embryos per animal, this production can be better, being the oocyte quality the more important aspect of the system. The objective of this study was to evaluate the methylation pattern of the differentially methylated region (DMR) in the exon 10 of the IGF2 gene in oocytes and cumulus cells (CC) from immature and maturated nellore cows follicles.of 1 3 mm and ≥ 8.1 mm diameter. Cumulus-oocytes complexes (COCs) from ≥ 8.1 mm follicles had greater percentages of viable oocytes (40.5%) and nuclear maturation (60.6%). Immature oocytes from 1 3 mm follicles were less methylated (33.33% ± 34.79 %) than those immature from ≥ 8.1 mm follicles (83.69% ± 8.52%). After maturation, the methylation pattern were different among oocytes groups, ≥ 8.1 mm maturated follicles showed less methylation (18.51% ± 36.36%) than ≥ 8.1 mm immature follicles(83.69% ± 8.52%) and 1-3 mm maturated follicles (49.62% ± 34.00%). When evaluating only the oocytes by follicle size or maturation degree, these groups showed no significant differences between them. The CC showed no significant differences among treatments evaluated. The less methylated DMR pattern in the oocytes from ≥ 8.1 mm maturated follicles can be related with greater competency of those oocytes, however oocytes from 1 3 mm follicles can be with imprinting patters not completely established yet. It is concluded that DMR of the last exon of the IGF2 gene can be used as a molecular marker for epigenetic reprogramming status in oocytes, helping the IVP in the development and changes of new protocols.Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível SuperiorMestre em Ciências VeterináriasAs biotecnologias de reprodução assistida são ferramentas essenciais à pecuária moderna. Dentre estas, a produção in vitro de embriões (PIVE) se destaca, colocando o Brasil como um dos países que mais produz e transfere embriões no mundo. Apesar da PIVE proporcionar um aumento na produção de embriões por animal, muito ainda se pode melhorar, sendo a qualidade do ovócito um dos aspecto mais importante do sistema. Neste trabalho, objetivou-se avaliar o padrão de metilação de uma região diferencialmente metilada (DMR) localizada no éxon 10 do gene IGF2 em ovócitos e células do cumulus (CC) de folículos de 1 3 mm e ≥ 8,1 mm, imaturos e maturados de vacas Nelore. Os complexos cumulus-ovócitos (COC) de folículos ≥ 8,1 mm apresentaram maior porcentagem de viáveis (40,5%) e de maturação nuclear (60,6%). Os ovócitos imaturos de folículos de 1 3 mm foram menos metilados (33,33% ± 34,79 %) que os de ≥ 8,1 mm (83,69% ± 8,52%). Após a maturação, o padrão de metilação foi diferente entre os grupos de ovócitos, sendo que os de folículos ≥ 8,1 mm maturados apresentaram menos metilação (18,51% ± 36,36%) que os de ≥ 8,1 mm imaturos (83,69% ± 8,52%) e os de 1 3 mm maturados (49,62% ± 34,00%). Ao avaliar os ovócitos apenas por tamanho do folículo ou estado de maturação, estes grupos não apresentaram diferenças significativas entre eles. As CC, não apresentaram diferenças significativas para nenhum dos tratamentos avaliados. O padrão menos metilado da DMR nos ovócitos de folículos ≥ 8,1 mm maturados pode estar relacionado à maior competência destes, sendo que os ovócitos de folículos de 1 3 mm podem ainda não estar com os padrões imprinting completamente estabelecidos. Conclui-se que a DMR do último éxon do gene IGF2 poderá ser usada como um marcador molecular para o status da reprogramação epigenética em ovócitos, auxiliando a PIVE no desenvolvimento e modificações de novos protocolos

Gene expression of cytokines in the bovine endometrium pre-sensitized with maternal and paternal antigens and in the inflammaton

Uterine infections soon after delivery and embryonic losses related to failures in the immunotolerance to the concept at the beginning of gestation are important causes of low reproductive efficiency in bovine breeding. The aim of this study was to compare the expression of the CCL5, IL-8, IL-6 and IL-1β genes in the endometrial mucosa with and without inflammation in the caruncular and intercaruncular regions using endometrial biopsy and cytobrush collection methods. Twenty uteri were used in the experiment after evaluation of the percentage of polymorphonuclear cells (PMNs) in endometrial cytology, being ten without PMNs, seven with PMNs ranging from 11 to 19% (soft endometrial inflammation) and three with PMNs between 75 and 81% (severe endometrial inflammation). These samples were collected, its RNAs were extracted, and then the reverse transcription and the qPCR reaction were performed for the quantification of the gene expression. No difference was observed in the gene expression between the caruncular and intercaruncular regions and the expression was dependent on the degree of inflammation. Soft inflammations did not present significant differences in comparison to uninflamed uteri. On the other hand, severe inflammation presented difference in comparison to the control group, independent of the collection method, biopsy or cytobrush. The influence of the endometrial collection technique in the gene expression was observed only in the severe inflammation, and the best results were observed in samples collected by cytobrush. This study had also the objective to understand the mechanisms of uterine immunotolerance to the concept by analyzing the IL-1β, IL-2, IL-6, IL-17, IFNG and LIF gene expression during the early gestation. Forty-five cows synchronized to estrus were submitted to intrauterine immunological induction, administered in D0 (estrus day), with four treatments: semen, PBMCs, semen and PBMCs and control (without induction). In vivo uterine biopsies were collected at three different times: the first at D0 (no immunological induction), the second at day seven (D7) and the final one at day 14 (D14) after immunological stimulation. After immunological induction, IL-1β mRNA expression was significantly reduced in all sensitized groups when compared to control. The IL-2 gene presented greater expression only in semen induction. It was likewise observed that IL-1β and IL-2 gene expression varied significantly between D0, D7 and D14 of the estrous cycle. The IL-6 gene did not show expression variations from the immunological inductions nor during the first 14 days of the estrous cycle. The results of the IL-17, IFNG and LIF genes were inconclusive. It was concluded that the identification of uterine inflammation through gene expression is only possible in severe cases, and the best results are observed in samples collected by cytobrush. In addition, the IL-1β and IL-2 gene expression can be modulated by immune-induction, suggesting that immunological sensitization may contribute to the success of gestation.CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível SuperiorTese (Doutorado)Infecções uterinas logo após o parto e perdas embrionárias relacionadas a falhas na imunotolerância ao concepto no início da gestação são importantes causas de baixa eficiência reprodutiva na bovinocultura. No presente estudo objetivou-se comparar a expressão dos genes CCL5, IL-8, IL-6 e IL-1β na mucosa endometrial com e sem inflamação, em regiões caruncular e intercaruncular, utilizando os métodos de coleta biopsia e cytobrush endometriais. Vinte úteros foram inseridos no experimento após avaliação da porcentagem de células polimorfonucleares (PMNs) na citologia endometrial, sendo dez sem a presença de PMNs (inflamação endometrial ausente), sete com PMNs variando entre 11 e 19% (inflamação endometrial leve) e três com PMNs entre 75 e 81% (inflamação endometrial grave). Após a coleta das amostras, foi feita a extração dos RNAs, em seguida realizada a transcrição reversa e a reação de qPCR para a quantificação da expressão gênica. Não foi observada diferença na expressão gênica entre as regiões carunculares e intercarunculares e a expressão foi dependente do grau de inflamação. Inflamações leves não apresentaram diferenças significativas em relação aos úteros não inflamados, existindo diferença apenas nas inflamações graves, tanto em amostras por biopsia como cytobrush. Houve influência da técnica de coleta de endométrio na expressão gênica somente na inflamação grave, sendo os melhores resultados observados em amostras colhidas por cytobrush. Este trabalho também teve como objetivo compreender os mecanismos da imunotolerância uterina ao concepto por meio de análise da expressão dos genes IL-1β, IL-2, IL-6, IL-17, IFNG e LIF, e o perfil destes durante o início da gestação. Foram utilizadas 45 vacas sincronizadas ao estro, submetidas à indução imunológica intrauterina, administrada no D0 (dia do estro), sendo quatro tratamentos: sêmen, PBMCs (células mononucleares de sangue periférico), sêmen e PBMCs e controle (sem indução). As biópsias uterinas in vivo foram coletadas em três momentos, D0 (sem indução imunológica) e dia sete (D7) e 14 (D14) após a estimulação imunológica. Após a indução imunológica, a expressão de RNAm do gene IL-1β reduziu significativamente em todos os grupos sensibilizados em comparação ao controle. O gene IL-2 apresentou maior expressão somente na indução com sêmen. Observou-se também que a expressão dos genes IL-1β e IL-2 variaram significativamente entre D0, D7 e D14 do ciclo estral. O gene IL-6 não apresentou variações de expressão entre as induções imunológicas e nem durante os primeiros 14 dias do ciclo estral. O resultados dos genes IL-17, IFNG e LIF foram inconclusivos. Conclui-se que a identificação de inflamações uterinas por meio de expressão gênica só foi possível nos casos graves, sendo os melhores resultados observados em amostras colhidas por cytobrush. E que a expressão dos genes IL-1β e IL-2 podem ser modulados por imunoindução, sugerindo que a sensibilização imunológica pode contribuir com o sucesso da gestação

Influence of the biostimulation on ovarian characteristics and pregnancy rate in nelore heifers Influência da bioestimulação sobre características ovarianas e taxa de prenhez em novilhas Nelore

The effects of biostimulation on the dimensions of ovarian structures, conception and pregnancy rates and weight gain were evaluated in Nelore heifers. In October 2005 the animals were divided in two treatments: biostimulated (BE), with the presence of vasectomized bulls with libido, and nonbiostimulated (NE), without the bull. Ultra-sonography exams were done for measurement of ovary, diameter of the largest follicle and corpora lutea when present, and also for pregnancy diagnose. Conception rate was of 100 and 80% and pregnancy rate of 62.5 and 25% for BE and NE groups, respectively. No changes on the initial and final ovarian dimensions or on the measurements of the diameter of the largest follicle and corpora lutea were observed between the groups. Treatments had significantly affected weight gain. Service rate per conception was smaller in BE. Biostimulation affect conception and pregnancy rate, but no effects on the ovary dimensions, diameter of the largest follicle and corpora lutea are observed. Decreasing weight gain and service rate per conception were observed in biostimulated heifers.Avaliou-se o efeito da bioestimulação nas dimensões das estruturas ovarianas, nas taxas de concepção e de prenhez e no ganho de peso em novilhas da raça Nelore. Em outubro de 2005, dividiram-se igualmente as fêmeas (n=32) em dois tratamentos: bioestimulado (BE) com a presença de rufião; e não-bioestimulado (NE) na ausência do mesmo. Realizaram-se exames de ultra-sonografia para mensuração dos ovários, do diâmetro do folículo maior e do corpo lúteo, quando presente, e para diagnóstico de gestação. A taxa de concepção nas fêmeas bioestimuladas foi de 100,0% e naquelas não-bioestimuladas, 80,0%, enquanto a taxa de prenhez foi de 62,5 e 25%, respectivamente. Não houve alterações nas dimensões iniciais e finais dos ovários nem diferenças nos diâmetros do folículo maior e do corpo lúteo em cada grupo. Houve diferença significativa entre os grupos para ganho de peso. O número de serviços por concepção foi menor no grupo bioestimulado. A bioestimulação influencia positivamente as taxas de concepção e prenhez, mas não interfere nas dimensões do ovário, no diâmetro do folículo maior e do corpo lúteo. Novilhas bioestimuladas reduzem o ganho de peso e o número de serviço por concepção

Characterisation of the methylation pattern in the intragenic CpG island of the IGF2 gene in Bos taurus indicus cumulus cells during in vitro maturation

The aim of this study was to characterise the methylation pattern in a CpG island of the IGF2 gene in cumulus cells from 1-3 mm and a parts per thousand yenaEuro parts per thousand 8.0 mm follicles and to evaluate the effects of in vitro maturation on this pattern.Genomic DNA was treatment with sodium bisulphite. Nested PCR using bisulphite-treated DNA was performed, and DNA methylation patterns have been characterised.There were no differences in the methylation pattern among groups (P > 0.05). Cells of pre-IVM and post-IVM from small follicles showed methylation levels of 78.17 +/- 14.11 % and 82.93 +/- 5.86 %, respectively, and those from large follicles showed methylation levels of 81.81 +/- 10.40 % and 79.64 +/- 13.04 %, respectively. Evaluating only the effect of in vitro maturation, cells of pre-IVM and post-IVM COCs showed methylation levels of 80.17 +/- 12.01 % and 81.19 +/- 10.15 %.In conclusion, the methylation levels of the cumulus cells of all groups were higher than that expected from the imprinted pattern of somatic cells. As the cumulus cells from the pre-IVM follicles were not subjected to any in vitro manipulation, the hypermethylated pattern that was observed may be the actual physiological methylation pattern for this particular locus in these cells. Due the importance of DNA methylation in oogenesis, and to be a non-invasive method for determining oocyte quality, the identification of new epigenetic markers in cumulus cells has great potential to be used to support reproductive biotechniques in humans and other mammals