Doubled haploid production in Brassica L.

Doubled haploids (DHs) production through androgenesis is a biotechnological method for genetic improvement of crops. Biotechnological DH line production offers advantages to plant breeders, including the possibility to obtain homozygous lines within a year in contrast to common inbreeding methods, which may take 6–12 years. The greatest success in androgenesis has been achieved in some varieties of rapeseed (Brassica napus L.). However, the efficiency of androgenesis in other Brassica species is still poor. Induction of microspore embryogenesis is usually induced by many factors such as conditions of donor plant growth, genotype, microspore developmental stage, culture medium composition, and culture conditions. The reprogramming of microspores from the gametophytic to the sporophytic habit of development depends on various stress factors. Certain pretreatments of microspores, such as high temperature and colchicine, can favor androgenesis in Brassica species. Plant regeneration from microspores can be improved by proper application of different growth regulators (ethylene, abscisic acid, and indole acetic acid). Optimal combinations of these factors are mandatory for efficient androgenesis. In this review, we summarize the experience of our colleagues in DH-technology in the Brassica genus. Attention is focused on some factors influencing the development of doubled haploid plants and their impact on enhancing the efficiency of androgenesis in Brassica species

Международная научно-практическая конференция «Инновационные биотехнологии в странах ЕврАзЭС» И ВЫСТАВКА «БИОИНДУСТРИЯ 2012»

October 10-13, 2012 in Saint-Petersburg (Russia) the International Conference «Innovative biotechnologies in countries of EuroAsian Economic Community» and Exhibition «Bioindustry 2012» were held. These meetings were devoted to the development and extension of fundamental and applied biotechnologies in countries of EuroAsian Economic Community.С 10 по 13 октября 2012 года на базе «Экспоцентра» города Санкт-Петербурга (Россия) проходила Международная научно-практическая конференция «Инновационные биотехнологии в странах ЕврАзЭС» и выставка «Биоиндустрия 2012», посвященные развитию фундаментальной и прикладной биотехнологии в странах Евразийского экономического сообщества

ОСОБЕННОСТИ ЗАВЯЗЫВАНИЯ СЕМЯН У ЛИНИЙ УДВОЕННЫХ ГАПЛОИДОВ КАПУСТЫ БРОККОЛИ В РАЗНЫХ ПОКОЛЕНИЯХ

The biotechnological methods enable to produce the ‘pure’ lines for the short period of time that intensify the breeding program. Particularly, the anther culture is widely used to obtain double haploid lines (DH lines) in plant breeding. The technology advantage is to fast up essentially the selection of homozygous lines with different morphological traits and high level of uniformity. Contemporary breeding programs are directed at F1 hybrid development; therefore DH lines are in need to serve as the parental form for heterotic hybrid production. Nevertheless, previous data has shown that DH plants have been noticed to produce few seeds on them. To introduce the lines into breeding program for hybrid production and to multiply them, the seed formation of DH lines is worth being studied. The result of assessment of seed generation of DH lines of Broccoli that have been produced from ‘Tonus’ and convariety ‘N1’ is presented in the article There is much difference in morphological traits and both ability to recognize their own pollen and quantity of seeds in the pod among plants produced. Nine DH lines of early maturity were obtained. The differences in seed formation among these lines and between generations were revealed. It was shown the influence of genotype on seed formation in DH lines. It was also noticed the much seed formation in case of geitonogamic pollination in DH lines obtained from cultivar ‘Tonus’. The biological features of flowering in DH lines under conditions of climatic chambers have been studied

ПЕРСПЕКТИВЫ ПОЛУЧЕНИЯ УДВОЕННЫХ ГАПЛОИДОВ РАСТЕНИЙ СЕМЕЙСТВА CUCURBITACEAE

In this review, the experience of Russian and foreign scientists in field of development of technology of doubled haploids (DHs) of Cucurbitaceae crops is summarized. The different factors affected on the development of DH-plants and the ways of increasing of yield of double haploids are described in the article.гиногенез и партеногенез – один из способов генетического улучшения сельскохозяйственных растений. С помощью DH-технологии полностью гомозиготные растения можно получить в течение одного года, в отличие от классических методов селекции, при использовании которых процесс инбридинга занимает 6–12 лет. Для получения гаплоидов у представителей семейства Тыквенные (Curbitaceae) наиболее успешно разработаны технологии с использованием партеногенеза (опыление растений облученной пыльцой) и гиногенеза (культура неопыленных семяпочек in vitro). На эффективность DH-технологии влияют многочисленные факторы: условия выращивания донорных растений, их генотип, стадия развития мешка, состав питательной среды, условия культивирования. Оптимальное значение и комбинация этих факторов являются необходимым условием для успешного эмбриогенеза. В данной обзорной статье обобщен опыт зарубежных и российских ученых в области разработки технологии получения удвоенных гаплоидов тыквенных культур, показаны различные факторы, влияющие на процессы получения DH-растений, а также подходы, позволяющие повысить выход гаплоидов

ПОВЫШЕНИЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ ОПЫЛЕНИЯ КАПУСТЫ БЕЛОКОЧАННОЙ В СЛУЧАЕ НИЗКОЙ ЖИЗНЕСПОСОБНОСТИ ПЫЛЬЦЫ

The way of improvement of the efficiency of white head cabbage pollination in case of low pollen viability is presented. The optimal culture medium with Tris maintaining pH 8$9 for germination of cabbage pollen was determined.  Pollination of style by the suspension of pollen in the optimal culture medium was suggested. This method allows obtaining of seeds of doubled haploid plants with partially sterile pollen.В статье отражены результаты исследований по разработке способа повышения эффективности опыления капусты белокочанной в случае низкой жизнеспособности пыльцы. Подобрана оптимальная питательная среда для проращивания пыльцы капусты белокочанной, содержащая Трис, поддерживающий значение рН 8,9, и предложено наносить пыльцу на рыльце пестика в виде суспензии в этой среде. Использование такого приема позволило получить семена у удвоенных гаплоидных растений с частично стерильной пыльцой

Получение DH-растений огурца (Cucumis sativus L.) в культуре неопыленных семяпочек in vitro

Relevance. The development of F1 hybrids distinguishing it from cultivars by high productivity, plant uniformity in ripening date, fruit sizes and quality is the promising trend in breeding program in cucumber (Cucumis sativus L.).The aim of the study was to optimize the gynogenesis induction condition in culture of unpollinated ovules in vitro in order to broad the generation of new breeding forms and to accelerate homozygous line production.Materials and methods. Eight promising cucumber accessions from Laboratory of Cucurbit Breeding and Seed Production (FSBSI FSVC) were taken for the study. The protocol developed in Laboratory of Biotechnology (FSBSI FSVC) for production of doubled haploid in Cucurbitaceae family was used in the experiment. The medium IMC with 30 g/L sucrose and 7g/L agar supplemented with 200 mg/L ampicillin and 0.2 mg/L thidiazuron (TDZ) was applied to induce gynogenic development.Results. The half-open bud or flower was shown to be the most suitable to be taken as an explant for cultivation. Highest number of embryo-like structures in all accessions developed from ovaries 2.1-2.6 cm long. Exposure to sterilization solution of sodium hypochlorite for 15 min made ovary wall softer and ovules can be then easily extracted without traumatizing. The traumatized ovule resulted in inhibited gynogenic development. Embryoids and calli had developed in all studied cucumber accessions, but well-formed plants were only obtained in six accessions. In total 26 plants were produced. The maximum gynogenesis induction equal to 63.1% was achieved in accession 1810. Maximum number of plant produced was twelve in accession 1763, but the greatest plant outcome 7.7% of the ovules with induced gynogenesis was observed in accession 1807. Актуальность. Приоритетным направлением в селекции огурца (Cucumis sativus L.) является создание гибридов F1, которые отличаются от сортов высокой урожайностью, выравненностью растений по срокам созревания, размерам и качеству продуктивных органов.Целью данного исследования являлась оптимизация условий индукции гиногенеза в культуре неопыленных семяпочек in vitro для расширения спектра формообразования и ускоренного создания гомозиготных линий.Материалы и методы. В исследование были включены восемь перспективных коллекционных образцов огурца лаборатории селекции и семеноводства тыквенных культур ФГБНУ ФНЦО. В ходе экспериментов использовали протокол получения удвоенных гаплоидов для культур семейства Cucurbitaceae в культуре неопыленных семяпочек in vitro, разработанный в лаборатории биотехнологии ФГБНУ ФНЦО. Для индукции гиногенеза использовали питательную среду IМС с 30 г/л сахарозы, 7 г/л агара, 200 мг/л ампициллина и 0,2 мг/л тидиазурона (ТДЗ).Результаты. Оптимальным для введения в культуру является полураскрывшийся бутон или цветок в утренние часы. Наибольшее количество эмбриоподобных структур у изученных генотипов образуется из бутонов с размером завязи 2,1-2,6 см. Нахождение в стерилизующем растворе гипохлорита натрия в течение 15 минут способствует размягчению стенок завязи, в результате чего семяпочки удается извлекать более легко и менее травматично. Повреждение семяпочки при выделении ее из завязи ингибирует гиногенез. Индуцировать образование эмбриоидов и каллуса удалось у всех восьми включенных в исследование образцов огурца, а получить полноценные растения только из шести образцов. Всего было получено 26 растений. Максимальная индукция гиногенеза наблюдалась у образца "1810" и составляла 63,1%. Максимальное количество растений – 12 штук было получено у образца "1763", а у образца "1807" наблюдался наибольший выход растений от числа индуцированных семяпочек – 7,7%.

ОБРАЗОВАНИЕ АНОМАЛЬНЫХ ЦВЕТКОВ В ПОТОМСТВЕ УДВОЕННЫХ ГАПЛОИДОВ КАБАЧКА (CUCURBITA PEPO L.)

The culture of unpollinated ovules in vitro in summer squash was used to develop fully homozygous breeding lines with the aim of the speeding-up breeding program. As a result of assessment for economically valuable traits, the seven promising DH-lines obtained from summer squash accessions differed by fruit shapes and colours were selected out. All breeding lines produced showed high homogeneity that retained in following generations and also have an appropriate set of economically valuable traits. DH-lines belonging to female type have up to 96% female flowers and only 4% male flowers. It is very important for breeding when the male flowers appeared in two weeks just after the female flower began blooming. The development of morphologically abnormal female and male flowers, along with gynandromorphy flowers was noted on selected DH-lines. During vegetation period from 26 to 36 flowers appeared on the plant, where out of them 19-21 ones were normally developed female flowers, 3-5 ones were normally developed male flowers, and up to 10-11 ones showed an abnormal way of development. The percentage of abnormal flowers stayed invariable when growing in greenhouse condition with high humidity and temperature as well as in open field condition. As it was shown the development of deformed abnormal flowers inherited and manifested in the following generation after self-pollination. As a result of the study, the occurred anomalies in course of male and female flower development in summer squash (C. pepo L.,) DH-lines produced through a cultivation of unpollinated ovules in vitro were described in details for the first time.Культуру неопыленных семяпочек кабачка in vitro использовали для создания полностью гомозиготных линий с целью ускорения селекционного процесса. В результате проведенной оценки по хозяйственно ценным признакам было выделено семь перспективных DH-линий, полученных из разных селекционных образцов кабачка, отличающихся по форме и окраске плода. Все полученные линии отличались высокой однородностью, сохраняющейся при последующем размножении, и были наделены комплексом хозяйственно ценных признаков. DH-линии относились к женскому типу и имели до 96% женских цветков и лишь 4% мужских, причем мужские цветки появлялись через две недели после начала цветения женскими цветками, что представляет большую селекционную ценность. На отобранных DH-линиях было отмечено формирование морфологически аномальных женских и мужских цветков, а также гинандроморфных цветков. За период вегетации на одном растении образовывалось от 26 до 36 цветков, при этом 19-21 штук из них были нормально развитыми женскими цветками, 3-5 штук – нормальными мужскими цветками и до 10-11штук цветков развивались с той или иной аномалией. Процент уродливых цветков на этих линиях оставался неизменным, как при выращивании этих линий в пленочной теплице, где температура воздуха и влажность была достаточно высокой, так и в условиях открытого грунта. При самоопылении этих линий образование уродливых аномальных цветков наследовалось и проявлялось у потомства. В результате проведенной работы были описаны встречающиеся аномалии в развитии мужских и женских цветков кабачка C. pepoL., обнаруженные в DH-линиях, полученных через культуру неопыленных семяпочек in vitro, часть из которых была обнаружена впервые

ИЗУЧЕНИЕ ЭФФЕКТ ГЕТЕРОЗИСА ПЕРЦА СЛАДКОГО ПРИ ПОДБОРЕ РОДИТЕЛЬСКИХ ПАР С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ДАННЫХ МОЛЕКУЛЯРНОГО АНАЛИЗА

Based on the results of molecular-genetic analysis of pepper accessions of VNIISSOK's breeding, the parental lines were selected. The diallel crossing among them has been conducted. The F1 hybrids were developed. The hybrids vigor (heterosis) for main agronomic traits was estimated. The best pepper hybrids were selected. The potential correlation between genetic divergence determined by molecular markers and heterosis effect is speculated.По результатам молекулярно-генетического анализа сортообразцов перца селекции ВНИИССОК подобраны родительские пары и проведены диаллельные скрещивания между ними. В результате получены гибриды F1, рассчитан эффект гетерозиса по основным хозяйственно ценным признакам. Выявлены лучшие гетерозисные гибридные комбинации. Проведены исследования по выявлению взаимосвязи между уровнем генетической дивергентности, определенной с помощью молекулярного маркирования, и эффектом гетерозиса

ПОЛУЧЕНИЕ DH-РАСТЕНИЙ В КУЛЬТУРЕ МИКРОСПОР МОРКОВИ

The main goals of the research were to study the factors affecting on the process of embryogenesis in culture of isolated microspores, optimize the existing protocols, and finally produce the doubled haploid plants in carrot (DH-plants). Out of 10 carrot accessions tested in 2017 the embyoids were obtained in 8 carrot accessions with the use of 5 different media. The highest yield of embyoids was obtained in accessions 7kt (84 embryoids per Petri dish). It was shown that       optimal                explants              were     buds      containing microspores at late vacuolated uninucleate stage. The first divisions in microspores were seen in 3 days of cultivation. After 40 days, the welldeveloped embryoids can be observed by naked eye. It was also shown that further cultivation of these embryoids on medium with 13% agarose over 60 days provoked the active secondary embryoid formation. Owing to this, it is recommended to place the embryoids at heart-shaped stages on another regeneration medium supplied with 2 % of agarose, enabling to register correctly the number of well-formed embryoids. We carried out the study on influence of such factors as genotype and composition of medium, and their combination on embryoid formation in 8 genotypes on 5 various media. ANOVA analysis showed that the plant genotype was the main factor causing the embryoid formation, whereas the effect of both factors had an impact on the number of embryoids developed. The counting the chromosome number in meristem cells and also observation of chloroplast number in stoma guard cells enabled to reveal that most of the plants produced were the doubled haploidsЦелью данного исследования было изучить факторы, влияющие на процесс эмбриогенеза в культуре изолированных микроспор in vitro, оптимизировать существующие протоколы и получить удвоенные гаплоиды моркови (DH-растения). Из 10 изученных в 2017 году сортообразцов нам удалось получить эмбриоиды у 8 сортообразцов с использованием 5 различных вариантов питательных сред. Наибольший выход эмбриоидов наблюдался у селекционного образца 7кт (84 эмбриоида на чашку Петри). Было отмечено, что оптимальными для введения в культуру являются бутоны, содержащие преимущественно микроспоры на поздней вакуолизированной стадии развития. Первые деления в культуре микроспор моркови под микроскопом были обнаружены уже через 3 дня после начала культивирования. На 40 сутки эмбриоиды были хорошо сформированы и видны невооруженным глазом. Было отмечено, что если продолжать культивировать эмбриоиды на питательной среде с 13% сахарозой более 60 суток, то активно начинается процесс образования вторичных эмбриоидов. В связи с этим мы рекомендуем эмбриоиды на сердцевидной стадии развития сразу же переносить в отдельные пробирки на регенерационную среду с 2% сахарозой, чтобы вести правильный учет образовавшихся эмбриоидов. Мы провели изучение влияния факторов генотипа и питательной среды, а также их совместного действия на образование эмбриоидов у 8 генотипов моркови на 5 различных питательных средах. Проведенный двухфакторный дисперсионный анализ показал, что генотип является главным фактором определяющим образование эмбриоидов из микроспор, а совместное действие обоих факторов также определяет количество образовавшихся эмбриоидов. Прямым подсчетом числа хромосом в меристематических клетках и с использованием метода подсчета хлоропластов в замыкающих устьичных клетках было установлено, что почти все полученые растения были удвоенными гаплоидами

FEATURES OF SEED FORMATION IN DOUBLE HAPLOID LINES OF BROCCOLI IN DIFFERENT GENERATIONS

The biotechnological methods enable to produce the ‘pure’ lines for the short period of time that intensify the breeding program. Particularly, the anther culture is widely used to obtain double haploid lines (DH lines) in plant breeding. The technology advantage is to fast up essentially the selection of homozygous lines with different morphological traits and high level of uniformity. Contemporary breeding programs are directed at F1 hybrid development; therefore DH lines are in need to serve as the parental form for heterotic hybrid production. Nevertheless, previous data has shown that DH plants have been noticed to produce few seeds on them. To introduce the lines into breeding program for hybrid production and to multiply them, the seed formation of DH lines is worth being studied. The result of assessment of seed generation of DH lines of Broccoli that have been produced from ‘Tonus’ and convariety ‘N1’ is presented in the article There is much difference in morphological traits and both ability to recognize their own pollen and quantity of seeds in the pod among plants produced. Nine DH lines of early maturity were obtained. The differences in seed formation among these lines and between generations were revealed. It was shown the influence of genotype on seed formation in DH lines. It was also noticed the much seed formation in case of geitonogamic pollination in DH lines obtained from cultivar ‘Tonus’. The biological features of flowering in DH lines under conditions of climatic chambers have been studied