Investigation of leukocytes by flow cytometry and molecular techniques in myelodysplastic and myelodysplastic. myeloproliferative syndromes: method validation and correlation with other clinical and laboratory parameters

Background: The myelodysplastic syndromes (MDS) comprise a heterogeneous group of clonal haematological disorders characterised by dysplasia and ineffective haematopoiesis [1-3]. MDS patients carry an approximate 25% risk of progression to acute myeloid leukaemia [3]. The hallmark of MDS is morphologic dysplasia involving one or more bone marrow cell lineages. Although the diagnostic criteria for MDS are well established, a significant number of MDS patients display peripheral blood and bone marrow findings without robust diagnostic morphologic characteristics. In the proposed minimal essential criteria to meet the diagnosis of MDS, in International Working Conference in Vienna (2006) [1], bone marrow flow cytometric analysis was introduced as a useful co-criterion in cases where morphology and cytogenetics are equivocal. The use of flow cytometric data is not limited to diagnostic purposes only but may have potential prognostic value for the patients as well. Aim: The purpose of the study was the standardization and harmonization methodology and reagents in order to increase the general impact and awareness of this important approach to MDS, and to facilitate its use as a general standard in clinical practice. Material and Method: A) A 4-color-multiparametric flow cytometry with an extensive panel of monoclonal antibodies [CD3, CD4, CD5, CD7, CD10, CD11b, CD13, CD14, CD15, CD16, CD19, CD33, CD34, CD36, CD38, CD45, CD45RO, CD45RA, CD56, CD62L, CD64, CD79a, CD116, CD117, anti-HLA-DR, anti-KOR-SA, anti-MPO, anti-LF, anti-TCRγδ, 7AAD] in BM specimens of Controls (Ν=17) and patients with MDS (Ν=72), MDS/MPD (Ν=13) and MDS/AL (Ν=9) as well as in PB specimens of Controls (Ν=41) and patients with MDS (Ν=22), MDS/MPD (Ν=8) και MDS/AL (Ν=6) was used for patients immunophenotyping. All MDS and MDS/MPD patients were classified as lower-risk and higher-risk MDS, according to NCCN. B) Validation of leukocytes subsets immunophenotyping was also performed. C) Specimens with malignant populations (B-Chronic Lymphocytic Leukemia, Acute Myeloblastic Leukemia and Myelodysplastic Syndrome) were studied in order to evaluate the suitability of a blood stabilizing reagent (Transfix®) in routine laboratory practice. D) TCR Vβ (by FC) and TCR Vγ (by PCR) clonality investigation was performed in PB specimens, E) Oxidative burst and Phagocytosis tests were performed, by FC, in ΡΒ specimens and F) DNA analysis assessment, by FC, was performed in BM specimens. Results: The within day precision of the method (N=6) was found satisfactory concerning all leukocytes subpopulations. Checking the precision in four consecutive days, lymphocytes percentages reliability was verified until day 3, in all specimens. For blast cells, neutrophil granulocytes and monocytes the results were different in each specimen. The present study, in agreement with international guidelines, indicates that specimen preparation and determination of lymphocytes subsets should be carried out as soon as possible after patient’s venepuncture. Method accuracy was evaluated both through external quality assessment system as well as by comparing measurements of the same specimen in two different flow cytometers and found acceptable. Dilution 1:16 of control specimen was found appropriate to define method detection limit of leukocytes subsets, a very important consideration when specimen volume is limited. The present study indicates that TransFix® stabilizing reagent can be used reliably in flow cytometric analysis; light scatter characteristics and immunophenotype are well preserved in TransFix®-treated specimens stored at 4-100C particularly concerning the blasts and lymphocytes populations for 15 days. In case cells percentages are limited, specimen preparation must be accomplished as soon as possible (in less than 24h). Bone marrow leukocytes immunophenotype investigation in blasts of MDS, MDS/MPD, and MDS/AL patients, compared to controls showed: increase of CD34+ blast cells, CD33, CD13, CD117 expression decrease or absence, expression of CD7 and CD11b, as well as CD34+CD19+ Β cells percentages decrease. Most disturbances were observed in higher-risk MDS patients, showing the correlation between phenotypic disturbances and progression to AL. After a detailed comparative analysis of granulocytes immunophenotype in MDS/MPD and MDS patients no significant differences in antigen expression profiles were found between the two groups, therefore MDS/MPD patients were included in this study. The investigation of Total Neutrophil Granulocytes (TNG) population from MDS cases in comparison to the controls revealed phenotypic patterns of dysplasia such as the decreased MPO/LF, CD16/MPO and CD16/LF co-expression percentages in MDS TNG, in addition to the findings observed by other investigators. These aberrancies were characterise lower-risk and higher-risk MDS, as well, and reflect the maturational abnormalities of the granulocytic series in the bone marrow of MDS patients and can de used as additional markers for diagnostic purposes. The population of TNG from higher-risk MDS cases displayed abnormal expression of HLA-DR. Our findings emphasise the importance of identifying the two distinct subpopulations within the TNG gate which were analysed in the gates of dimCD45 (NGS A) and strongCD45 (NGS B) signal in a CD45-SSc-plot. Controls NGS A represents a cell “mixture” of different maturational stages whereas NGS B consists mainly of mature neutrophil granulocytes expressing CD10+, CD11b+, CD13+, CD16+, MPO+ και LF+, in high percentages. The NGS A in MDS is a cell “mixture” of different maturational stages with abnormalities such as a higher percentage of myelocytes and an absence of metamyelocytes and bands as revealed from the patterns. The analysis of CD16, HLA-DR and CD16/CD11b expressions in the NGS A gate offers a clearer distinction between controls, lower-risk and higher-risk MDS than gating TNG. The NGS B in MDS is a mature population having high CD10, CD13 but with dysplastic features such as aberrant expression of HLA-DR, and lower CD16, CD16/CD11b, MPO/LF, CD16/MPO, CD16/LF percentages which were identified in some individuals with lower-risk MDS especially when the NGS B was separately studied. We think that these findings are consistent with the dysplastic characteristics of these patients. The comparison of bone marrow lymphocytes immunophenotype between patients with MDS and controls, showed B cells percentages decreasing and progressively moving from controls to lowerrisk and to higher-risk MDS. Neutrophil granulocytes peripheral blood immunophenotype analysis, in patients with MDS, compared to controls, was characterized by CD15/CD13, CD15/CD16, sCD11b/CD16 and MPO/LF co-expression decrease. These disturbances are more prominent in patients with higher-risk MDS. Monocytes PB immunophenotype analysis, showed progressive decrease of CD14, HLA-DR expression and CD36/CD116, HLA-DR/CD13, HLA-DR/CD38, co-expression as well as increase of CD64/CD16 co-expression, in patients with lower-risk MDS to higher-risk MDS. These parameters cannot discriminate between lower-risk MDS and controls. In contrast, the pathological increase of CD117 (immaturity marker) and CD16 (granulocytes marker) could discriminate lower-risk MDS patients from the controls and patients with higher-risk MDS. Lymphocytes ΡΒ immunophenotype analysis, showed percentages disturbances, such as CD4+ T lymphocytes increase (especially in lower-risk MDS) and CD8+ T cells decrease (in lower-risk MDS and higher-risk MDS), compared to controls. CD38 (activation marker) was progressively increased moving from controls to lower-risk and to higher-risk MDS. TCR Vβ clonality study, by FC, showed different disturbances. However, monoclonality was not observed neither by flow cytometry nor by PCR. Phagocytes functionality investigation, by FC, in patients with MDS and MDS/MPD, showed decrease of oxidative burst capacity in granulocytes and monocytes, compared to controls. Phagocytosis capacity was decreased specifically in granulocytes. The abnormalities were more pronounced in patients with higher-risk MDS. Additionally, statistically important were the correlations of phagocytes oxidative burst capacity with immunophenotype findings of dysplasia in bone marrow TNG, NGSs and monocytes. Aneuploidy was observed in patients’ bone marrow myeloid cell lineage. Bone marrow lymphoid cell lineage S phase, was progressively decreased moving from controls to lower-risk and to higher-risk MDS. These findings correspond to the progressive increase of the blast cells percentage and therefore to the disease progression to AL. Conclusions: In the present study bone marrow was found the most appropriate specimen for MDS and MDS/MPD investigation, because of its important findings. These findings concerned mainly the neutrophil granulocytes. It seems that this lineage is the most affected leukocytic population, after blast cells, in MDS. This work indicated that the multicolor flow cytometric analysis of NGSs is a useful aid in diagnosing MDS, especially regarding lower-risk MDS patients. This observation is important because sometimes the immunophenotypic disturbances in TNG are minor and not obvious, whereas the separate examination of the two NGSs might reveal the dysplastic features that otherwise would have been missed. Therefore the NGSs phenotypic analysis (especially of the NGS B subpopulation) using specific markers and patterns of expression, as described, seems to offer a clear advantage for dysplasia screening. It is conceivable that our ability to estimate and follow-up minor and advancing dysplasia by flow cytometry could help substantially in the development of a diagnostic and prognostic tool for patients with MDS. Additionally, monocytes and lymphocytes findings could contribute in MDS and MDS/MPD diagnosis and patients monitoring. It is noted that whereas bone marrow is the most important specimen for MDS and MDS/MPD evaluation, leukocytes immunophenotype analysis, by FC, can be also accomplished in peripheral blood, especially in patients with disease progression. As a result of this study, a protocol was evaluated for the investigation of Myelodysplastic Syndromes and Myelodysplastic/Myeloproloferative Diseases, by flow cytometry. This protocol is suitable for application in every clinical flow cytometry laboratory, and can be used for BM and/or PB specimen analysis after venepuncture or even some days later (using Transfix®). It is an important diagnostic and patients monitoring tool, which can contribute in the patients quality of life amelioration.Εισαγωγή: Τα Μυελοδυσπλαστικά σύνδρομα (Myelodysplastic Syndromes, MDS) αποτελούν ετερογενή ομάδα κλωνικών νοσημάτων, που προέρχονται από το πολυδύναμο αιμοποιητικό κύτταρο. Χαρακτηρίζονται από ανεπάρκεια αιμοποίησης και περιφερικές κυτταροπενίες ενώ συχνά ο μυελός των οστών εμφανίζεται υπερκυτταρικός, και το 25%, περίπου, των ασθενών παρουσιάζουν αυξημένο κίνδυνο εκτροπής προς οξεία μυελοβλαστική λευχαιμία. Συνέπεια της ετερογένειας των MDS, η μέχρι σήμερα δυσκολία διάγνωσης που παρατηρείται σε αρκετά περιστατικά και ιδιαίτερα στα χαμηλότερου κινδύνου MDS. Σκοπός: H ανάπτυξη πρωτοκόλλου μελέτης, με κυτταρομετρία ροής, για διάγνωση, πρόγνωση και παρακολούθηση των ασθενών με MDS και των ασθενών με MDS/MPD που θα μπορεί να χρησιμοποιηθεί άμεσα από κάθε εξειδικευμένο κλινικό εργαστήριο κυτταρομετρίας ροής. Υλικό-Μέθοδος: (Α) Μελέτη ανοσοφαινότυπου υποπληθυσμών λευκοκυττάρων με κυτταρομετρία ροής τετραπλού φθορισμού με εκτεταμένο panel μονοκλωνικών αντισωμάτων [CD3, CD4, CD5, CD7, CD10, CD11b, CD13, CD14, CD15, CD16, CD19, CD33, CD34, CD36, CD38, CD45, CD45RO, CD45RA, CD56, CD62L, CD64, CD79a, CD116, CD117, anti-HLA-DR, anti-KOR-SA, anti-MPO, anti-LF, anti-TCRγδ, 7AAD] σε δείγματα ΒΜ ελέγχου (Ν=17), ασθενών με MDS (Ν=72), MDS/MPD (Ν=13) και MDS/AL (Ν=9) και δείγματα ΡΒ ελέγχου (Ν=41), ασθενών με MDS (Ν=22), MDS/MPD (Ν=8) και MDS/AL (Ν=6). Οι ασθενείς με MDS και MDS/MPD διερευνήθηκαν και με βάση το σύστημα πρόγνωσης NCCN, ως «lower-risk MDS» και «higher-risk MDS». (Β) Επικύρωση της μεθόδου υποπληθυσμών λευκοκυττάρων με τετραπλό φθορισμό. (Γ) Μελέτη της επίδρασης του μονιμοποιητικού/συντηρητικού υλικού Transfix® στη βιωσιμότητα, τα χαρακτηριστικά σκέδασης και τα χαρακτηριστικά του αντιγονικού προφίλ των λευκοκυττάρων δειγμάτων ελέγχου (ImmunoTrolTM), περιφερικού αίματος υγιών μαρτύρων, ασθενών με B-CLL, AML, AML(M5), και MDS και μυελού των οστών ασθενούς με MDS. (Δ) Μελέτη κλωνικότητας υποδοχέων TCR Vβ, με ΚΡ, και TCR Vγ, με PCR (σε δείγμα ΡΒ ασθενών), (Ε) μελέτη λειτουργικότητας φαγοκυττάρων (έλεγχος οξειδωτικής έκρηξης και φαγοκυττάρωσης), με ΚΡ (σε δείγμα ΡΒ ελέγχου και ασθενών) και (ΣΤ) ανάλυση DNA, με ΚΡ (σε δείγμα ΒM ασθενών). Αποτελέσματα: Η λειτουργία του κυτταρομετρητή ροής κρίθηκε καλή. Η επαναληψιμότητα εντός ημέρας (Ν=6), υπέδειξε ότι ένα δείγμα μπορεί να μετρηθεί εντός της ημέρας χωρίς να χρειάζεται να μετρηθεί αμέσως μετά την κατεργασία του. Η αναπαραγωγιμότητα (μεταξύ τεσσάρων ημερών) κατέδειξε την αξιοπιστία της μέτρησης των ποσοστών μέχρι και την τρίτη ημέρα από την ημέρα επεξεργασίας των δειγμάτων, όσον αφορά τους υποπληθυσμούς των λεμφοκυττάρων, ενώ οι άλλοι κυτταρικοί πληθυσμοί παρουσίασαν διαφορές στη διατήρηση των παραμέτρων τους, ανάλογα με το δείγμα μελέτης. Ο έλεγχος ακρίβειας της μεθόδου του ανοσοφαινότυπου των λεμφοκυττάρων, με ΚΡ, που πραγματοποιήθηκε μέσω του διεργαστηριακού ελέγχου επίδοσης του UK-NEQAS και μέσω της σύγκρισης των μετρήσεων ιδίου δείγματος από δυο διαφορετικούς κυτταρομετρητές ροής κρίθηκε ικανοποιητική. Για τον προσδιορισμό του ορίου ανίχνευσης της μεθόδου προσδιορισμού των υποπληθυσμών των λευκοκυττάρων, αποδείχτηκε ως βέλτιστη η αραίωση 1:16 του δείγματος ελέγχου. Η προσθήκη TransFix® και η αποθήκευση στους 4-100C, στα δείγματα, διατήρησε κυρίως τα χαρακτηριστικά σκέδασης του φωτός και του ανοσοφαινότυπου των λεμφοκυττάρων και των αώρων κυττάρων για 15 ημέρες, ενώ τα κοκκιοκύτταρα και τα μονοκύτταρα διατηρήθηκαν μόνο στην περίπτωση που χαρακτηρίζονταν ως παθολογικόι πληθυσμοί. Στις περιπτώσεις όπου τα ποσοστά των πληθυσμών είναι πολύ χαμηλά συστήνεται η επεξεργασία και μέτρηση του δείγματος το συντομότερο δυνατό (σε διάστημα μικρότερο από 24h). Μελέτη του ανοσοφαινότυπου μυελού οστών υπέδειξε παθολογική αύξηση ποσοστών CD34+ αώρων κυττάρων, παθολογική μείωση ή απουσία έκφρασης CD33, CD13, CD117 και παθολογική έκφραση CD7 και CD11b, καθώς και μείωση του ποσοστού των CD34+CD19+ Β κυττάρων, ασθενών με MDS, MDS/MPD, και MDS/AL, σε σχέση με την ομάδα ελέγχου. Οι περισσότερες διαταραχές παρατηρήθηκαν στην ομάδα higher-risk MDS, υποδηλώνοντας την συσχέτιση του αριθμού των διαταραχών με πιθανή δυσμενή εξέλιξη. Η διερεύνηση του ανοσοφαινότυπου του συνόλου των ουδετερόφιλων κοκκιοκυττάρων (TNG), δειγμάτων ΒΜ, μεταξύ ασθενών με MDS και MDS/MPD κατέδειξε ότι δε μπορεί να γίνει διάκριση των δυο οντοτήτων μέσω του ανοσοφαινότυπου. Σύγκριση του ανοσοφαινότυπου TNG των ασθενών σε σχέση με την ομάδα ελέγχου επιβεβαίωσε την παρουσία χαρακτηριστικών δυσπλασίας όπως μειωμένα ποσοστά συνέκφρασης των MPO/LF, CD16/MPO και CD16/LF. Τα ευρήματα ενισχύονται και από τη διαταραχή μοτίβου συνέκφρασής τους, ειδικά στους ασθενείς με lower-risk MDS. Όσον αφορά τους ασθενείς με higher- risk MDS σημαντικός δείκτης δυσμενούς εξέλιξης του νοσήματός τους χαρακτηρίστηκε η παθολογική έκφραση του HLA-DR, στο TNG. Οι δύο υποπληθυσμοί ουδετερόφιλων κοκκιοκυττάρων (NGSs) καθορίστηκαν από τις διαφορετικές τιμές πλάγιου σκεδασμού και έντασης φθορισμού του CD45. Ως NGS A καθορίστηκε ο υποπληθυσμός με dimCD45 και ως NGS B ο υποπληθυσμός με strongCD45. Ο υποπληθυσμός NGS A, της ομάδας ελέγχου, φαίνεται να αποτελεί «μίγμα» διαφορετικών σταδίων ωρίμανσης, ενώ ο πληθυσμός NGS Β φαίνεται να αποτελείται από ώριμα ουδετερόφιλα κοκκιοκύτταρα, τα οποία εκφράζουν CD10+, CD11b+, CD13+, CD16+, MPO+ και LF+ σε υψηλά ποσοστά, σε σχέση με τον υποπληθυσμό NGS Α. Ο NGS Α, των ασθενών, χαρακτηρίζεται από διαταραχές ωρίμανσης όπως είναι τα υψηλά ποσοστά προμυελοκυττάρων και μυελοκυττάρων καθώς και η απουσία μεταμυελοκυττάρων και ώριμων κοκκιοκυττάρων, όπως φάνηκε από το μοτίβο έκφρασης των αντιγόνων. Ο NGS Β, στους ασθενείς, αποτελεί ώριμο πληθυσμό με στοιχεία δυσπλασίας όπως είναι η παθολογική έκφραση του HLA-DR, και το χαμηλό ποσοστό έκφρασης των CD16, CD16/CD11b, MPO/LF, CD16/MPO, CD16/LF, σε σχέση με τον NGS Β της ομάδας ελέγχου. Επισημαίνεται ότι σε κάποιες περιπτώσεις ασθενών με lower-risk MDS παρατηρήθηκαν ιδιαίτερα χαμηλά ποσοστά συνέκφρασης CD16+/MPO+, και CD16+/LF+ κατά τη μελέτη του NGS Β. Στον ανοσοφαινότυπο των μονοκυττάρων, δειγμάτων ΒΜ, παρατηρήθηκε μείωση έκφρασης του HLA-DR, στους ασθενείς με MDS και MDS/MPD, σε σχέση με την ομάδα ελέγχου, και πιο συγκεκριμένα, από lower-risk MDS προς higher-risk MDS. Στον ανοσοφαινότυπο των λεμφοκυττάρων, δειγμάτων ΒΜ, ασθενών με MDS και MDS/MPD, σε σχέση με την ομάδα ελέγχου, διαγνωστικά σημαντική ήταν η μείωση του ποσοστού των Β κυττάρων η οποία μειώνεται προοδευτικά από την ομάδα lower-risk MDS προς την ομάδα higher-risk MDS. Η εξέταση του ανοσοφαινότυπου των κοκκιοκυττάρων, δειγμάτων περιφερικού αίματος, ασθενών με MDS σε σχέση με την ομάδα ελέγχου, χαρακτηρίστηκε από μείωση ποσοστού των δεικτών μυελικής σειράς, CD15/CD13, CD15/CD16, sCD11b/CD16 και MPO/LF. Οι διαταραχές είναι περισσότερο διακριτές στους ασθενείς με higher-risk MDS. Ο ανοσοφαινότυπος των μονοκυττάρων, ΡΒ, εμφάνισε διαδοχική μείωση έκφρασης των CD14, HLA-DR και μείωση συνέκφρασης των CD36/CD116, HLA-DR/CD13 και HLA-DR/CD38, όπως και της αύξησης συνέκφρασης CD64/CD16, από την ομάδα των ασθενών με lower-risk MDS στην ομάδα ασθενών με higher-risk MDS. Οι παράμετροι αυτοί δε μπορούν να διακρίνουν, στις περισσότερες περιπτώσεις τους ασθενείς με lower-risk MDS από την ομάδα ελέγχου. Αντίθετα, η παθολογική αύξηση έκφρασης του δείκτη αωρότητας CD117 και του δείκτη CD16 μπόρεσε να διακρίνει τους ασθενείς με lower-risk MDS σε σχέση με την ομάδα ελέγχου και τους ασθενείς με higher-risk MDS. Ο ανοσοφαινότυπος των λεμφοκυττάρων, ΡΒ, των ασθενών, υπέδειξε διαταραχές όπως αύξηση των CD4+ T λεμφοκυττάρων (ιδιαίτερα στην ομάδα lower-risk MDS) και μείωση των CD8+ T (στις ομάδες ασθενών με lower- και higher-risk MDS), σε σχέση με την ομάδα ελέγχου. Προοδευτική αύξηση του ποσοστού του δείκτη ενεργοποίησης, CD38, παρατηρήθηκε από την ομάδα ασθενών με lower-risk προς την ομάδα ασθενών με higher-risk MDS. Κατά τον έλεγχο κλωνικότητας TCR Vβ, με ΚΡ, τα περισσότερα περιστατικά εμφάνισαν διαταραχές. Εντούτοις δεν παρατηρήθηκε μονοκλωνικότητα των Τ λεμφοκυττάρων εφαρμόζοντας τόσο ΚΡ όσο και PCR. Κατά τον έλεγχο λειτουργικότητας φαγοκυττάρων των ασθενών, τόσο τα κοκκιοκύτταρα όσο και τα μονοκύτταρα εμφάνισαν μείωση ικανότητας οξειδωτικής έκρηξης ενώ η ικανότητα φαγοκυττάρωσης φαίνεται να επηρεάζεται ιδιαίτερα στα κοκκιοκύτταρα. Οι διαταραχές είναι περισσότερο διακριτές στους ασθενείς με higher-risk MDS. Επίσης, σημαντικά στοιχεία είναι η συσχέτιση της ικανότητας της οξειδωτικής έκρηξης των κοκκιοκυττάρων και μονοκυττάρων με στοιχεία δυσπλασίας μέσω του ανοσοφαινότυπου. Επιπλέον, παρατηρήθηκε ανευπλοειδία των κυττάρων της μυελικής σειράς ασθενών, με αυξανόμενο ποσοστό ασθενών αυξανομένου του κινδύνου εξέλιξης του νοσήματος. Επίσης, παρατηρήθηκε η προοδευτική μείωση S φάσης των κυττάρων λεμφικής σειράς από τους ασθενείς με lower-risk MDS στους higher-risk MDS, που φαίνεται να αντιστοιχεί στο προοδευτικά αυξανόμενο ποσοστό των άωρων κυττάρων και κατ’ επέκταση σε ένδειξη εξέλιξης των υπό μελέτη νοσημάτων προς οξεία λευχαιμία. Συμπεράσματα: Στην παρούσα μελέτη επιβεβαιώθηκε η σημασία ανάλυσης του ανοσοφαινότυπου μυελού οστών που αποτελεί το ενδεικνυόμενο δείγμα μελέτης για τα MDS και MSD/MPD, αφού δίδει σημαντικά ευρήματα. Τα ευρήματα αφορούσαν κυρίως στην κοκκιώδη σειρά η οποία φαίνεται πως αποτελεί την περισσότερο επηρεασμένη κυτταρική σειρά των λευκοκυττάρων, μετά από τα άωρα κύτταρα. Μελέτη της κοκκιώδους σειράς απεκάλυψε στοιχεία που ανακοινώνονται για πρώτη φορά και η μεγάλη σημασία τους αφορά στο γεγονός ότι μπορούν να διακρίνουν περιστατικά ασθενών με «lower-risk MDS» (χαμηλού κινδύνου MDS), τα οποία αρκετά συχνά, λόγω απουσίας μορφολογικών και κυτταρογενετικών στοιχείων δε μπορούν να διαγνωστούν. Στοιχεία του ανοσοφαινότυπου των μονοκυττάρων και λεμφοκυττάρων μπορούν να συμβάλουν συμπληρωματικά τόσο στην διάγνωση όσο και στην παρακολούθηση των ασθενών. Επισημαίνεται ότι ο μυελός των οστών αποτελεί το δείγμα μελέτης στα νοσήματα αυτά, είναι, όμως, δυνατή η μελέτη και του ανοσοφαινότυπου των λευκοκυττάρων περιφερικού αίματος, ειδικά στους ασθενείς με πιθανή εκτροπή προς οξεία λευχαιμία αλλά και στους ασθενείς με MDS/MPD. Μέσω της διατριβής αυτής αναπτύχθηκε ένα πρωτόκολλο μελέτης των Μυελοδυσπλαστικών και Μυελοδυσπλαστικών/Μυελοϋπερπλαστικών συνδρόμων, το οποίο θα μπορεί να εφαρμοστεί σε κάθε εργαστήριο ρουτίνας άμεσα, μετά τη λήψη του δείγματος αλλά και μέρες μετά (με τη χρήση Transfix®) προσφέροντας ένα επιπλέον εργαλείο διάγνωσης και παρακολούθησης το οποίο θα συμβάλει στη βελτίωση της ποιότητας ζωής του ασθενούς

Extracorporeal photopheresis in refractory chronic graft-versus-host disease: The influence on peripheral blood T cell subpopulations. A study by the Hellenic Association of Hematology

Extracorporeal photopheresis (ECP) has been established as an effective treatment modality for patients with chronic extensive graft-versus host disease (GVHD). In the present study, we evaluated the influence of ECP on the numbers of CD4(+), CD8(+), CD20(+), CD56(+) cells, and on T-regulatory (Tregs), as well as on the numbers of naive, central memory (CM), and effector memory (EM) T-cells in patients treated for refractory chronic GVHD. Flow cytometric analysis of peripheral blood lymphocytes was performed for the calculation of the different T-cell subsets. Patients with GVHD had a higher percentage of EM-CD4(+) cells in comparison with healthy donors (p = 0.046). The percentages of naive-CD8(+), naive-CD4(+), CM-CD8(+), CM-CD4(+), EM-CD8(+), and Tregs were not different between patients with GVHD and healthy donors. Similarly there was no statistical difference in the percentages of naive, CM, and EM CD4(+) and CD8(+) cells before and after 3 months of treatment with ECP. However, in the subset of Tregs a statistically significant increase was observed after 3 months of treatment with ECP (p = 0.015). Responders to ECP had statistically significantly higher absolute numbers of CD4(+), and CD8(+) cells, in comparison with non-responders. These data further support the concept that ECP does not cause immune-suppression, but should be better considered as an immune-modulating treatment. (C) 2011 Elsevier Ltd. All rights reserved