Proteasome activity contributes to prosurvival response upon mild mitochondrial stress in Caenorhabditis elegans

Defects in mitochondrial function activate compensatory responses in the cell. Mitochondrial stress that is caused by unfolded proteins inside the organelle induces a transcriptional response (termed the “mitochondrial unfolded protein response” [UPRmt]) that is mediated by activating transcription factor associated with stress 1 (ATFS-1). The UPRmt increases mitochondrial protein quality control. Mitochondrial dysfunction frequently causes defects in the import of proteins, resulting in the accumulation of mitochondrial proteins outside the organelle. In yeast, cells respond to mistargeted mitochondrial proteins by increasing activity of the proteasome in the cytosol (termed the “unfolded protein response activated by mistargeting of proteins” [UPRam]). The presence and relevance of this response in higher eukaryotes is unclear. Here, we demonstrate that defects in mitochondrial protein import in Caenorhabditis elegans lead to proteasome activation and life span extension. Both proteasome activation and life span prolongation partially depend on ATFS-1, despite its lack of influence on proteasomal gene transcription. Importantly, life span prolongation depends on the fully assembled proteasome. Our data provide a link between mitochondrial dysfunction and proteasomal activity and demonstrate its direct relevance to mechanisms that promote longevity

Seizures induced by pentylenetetrazole in the adult zebrafish : a detailed behavioral characterization

Pentylenetetrazole (PTZ) is a common convulsant agent used in animal models to investigate the mechanisms of seizures. Although adult zebrafish have been recently used to study epileptic seizures, a thorough characterization of the PTZinduced seizures in this animal model is missing. The goal of this study was to perform a detailed temporal behavior profile characterization of PTZ-induced seizure in adult zebrafish. The behavioral profile during 20 min of PTZ immersion (5, 7.5, 10, and 15 mM) was characterized by stages defined as scores: (0) short swim, (1) increased swimming activity and high frequency of opercular movement, (2) erratic movements, (3) circular movements, (4) clonic seizure-like behavior, (5) fall to the bottom of the tank and tonic seizure-like behavior, (6) death. Animals exposed to distinct PTZ concentrations presented different seizure profiles, intensities and latencies to reach all scores. Only animals immersed into 15 mM PTZ showed an increased time to return to the normal behavior (score 0), after exposure. Total mortality rate at 10 and 15 mM were 33% and 50%, respectively. Considering all behavioral parameters, 5, 7.5, 10, and 15 mM PTZ, induced seizures with low, intermediate, and high severity, respectively. Pretreatment with diazepam (DZP) significantly attenuated seizure severity. Finally, the brain PTZ levels in adult zebrafish immersed into the chemoconvulsant solution at 5 and 10 mM were comparable to those described for the rodent model, with a peak after a 20-min of exposure. The PTZ brain levels observed after 2.5-min PTZ exposure and after 60-min removal from exposure were similar. Altogether, our results showed a detailed temporal behavioral characterization of a PTZ epileptic seizure model in adult zebrafish. These behavioral analyses and the simple method for PTZ quantification could be considered as important tools for future investigations and translational research

Modulações energéticas cerebrais permitem a manutenção de crises epilépticas prolongadas

Epilepsia é uma desordem neurológica que afeta o sistema nervoso central, predispondo o paciente a crises recorrentes, as quais apresentam uma alta demanda energética cerebral, e que culminam na depleção dos níveis de glicose cerebrais conforme a crise epiléptica progride de aguda (até 5 min) à prolongada (de 5 min até algumas horas). A presente tese mapeou os diferentes modelos de crises e síndromes epilépticas com enfoque em peixe-zebra, no intuito de selecionar o melhor modelo em nosso universo experimental para investigar quais outros substratos energéticos poderiam ser utilizados pelo cérebro frente ao hipometabolismo da glicose em crises epilépticas prolongadas induzidas por pentilenotetrazol. Hipotetizou-se um ambiente produtor de peróxido de hidrogênio como agente modulatório do metabolismo energético neste tipo de crise epiléptica. Para tanto se caracterizou o protocolo de respirometria de alta resolução em dissociado cerebral de peixe-zebra adulto. Os peixes foram expostos a pentilenotetrazol por diferentes tempos. Detectou-se um desacoplamento entre o metabolismo da glicose e o consumo de O2 para produção de ATP em crises epilépticas prolongadas de 20 min. Neste momento, testou-se o impacto dos seguintes substratos energéticos sobre o consumo de O2 para produção de ATP: L-glutamato, L-glutamina, L-lactato, e β-hidroxibutirato. Também foi avaliado o sistema pró/antioxidante em amostras de cérebro de peixe-zebra adulto submetido a crises epilépticas prolongadas por 20 min (CEUA – 28043). Os resultados indicam o uso do L-glutamato e da L-glutamina como substratos energéticos para a manutenção de crises epilépticas prolongadas, e um ambiente favorável à produção de peróxido de hidrogênio, pela redução da atividade do Complexo I mitocondrial, pelo aumento da atividade das enzimas superóxido dismutase e glutationa peroxidase, e pelo aumento da oxidação de diclorofluoresceína. A literatura aponta para uma inibição da glicerol-3-fosfato-desidrogenase e piruvato-cinase, e uma ativação da glicose-6-fosfato-desidrogenase por aumento de peróxido de hidrogênio, o que culmina na diminuição da utilização da glicose como substrato energético. A completa oxidação do glutamato na presença de baixos níveis de piruvato ocorre via saída do malato da matriz mitocondrial e sua conversão a piruvato pela enzima málica. Ambas as enzimas produtoras de Fosfato de dinucleótido de nicotinamida e adenina reduzida citadas acimas apresentam atividade aumentada no modelo de convulsão abordado. Portanto, o metabolismo glutamatérgico é fundamental para a manutenção energética, e para a atividade de defesas antioxidantes em momentos de crises epilépticas prolongadas induzidas por pentilenotetrazol em peixe zebra adulto.Epilepsy is a brain disorder, which promotes the predisposition to events of high energy expenditure known as epileptic seizure. As epileptic seizure progress form acute (until 5 min of duration) to prolonged (above 5 min of duration), lower is the concentration of glucose in the brain. This thesis mapped all models of zebrafish epileptic seizure and epileptic syndrome to choose the best model in our experimental conditions to evaluate the impact of other substrates under glucose brain hypometabolism related to prolonged epileptic seizure induced by pentylenetetrazole. It was hypothesized that an environment with high concentrations of hydrogen peroxide could be connecting with the fast metabolic modulation in this model. To do so, the highresolution respirometry protocol for zebrafish brain dissociated was characterized. Fish were exposed to pentylenetetrazole by different duration. There was a decoupling between glucose brain metabolism and O2 consumption to ATP synthesis after 20 min of exposure to pentylenetetrazole. At this moment, the impact of the following substrates were measured under O2 consume to ATP synthesis: L-glutamate, L-glutamine, L-lactate, and β-hydroxybutyrate. The redox balanced was evaluated as well (CEUA – 28043). Data indicate L-glutamate and L-glutamine as the main energy substrate to maintain prolonged epileptic seizure. There was an environment prone to hydrogen peroxide, because mitochondrial complex I activity was impered, and the enzymes superoxide dismutase and glutamine peroxidase were activity, as well as the oxidation of diclorofluoresceine was increased. Hydrogen peroxide activates glucose-6-phosphate-dehydrogenase, and inhibits glycerol-3-phosphatedehydroganase as well as piruvate kinase. Therefore the glucose metabolism would be modulated to antioxidant defense instead of glycolysis. In low pyruvate concentrations, malate from glutamate is transported to the cytosol and converted to pyruvate and Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate. The activity of glucose-6- phosphate-dehydrogenase and citosolic malic enzyme were increased. Therefore, glutamate metabolismo is imperative to energy maintain prolonged epileptic seizure and to antioxidante defense to avoid further damage

Encefalopatia hepática induzida pelo modelo de ligação do ducto biliar e seu impacto comportamental.

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Padronização da atividade total da glutamato descarboxilase em cérebro de ratos

O ácido γ-aminobutirico (GABA) é o principal neurotransmissor inibitório do sistema nervoso central (SNC) de mamíferos. A sua síntese é mediante a uma reação catalítica envolvendo a descarboxilação do glutamato através da atividade da glutamato descarboxilase (GAD). O Objetivo deste estudo foi padronizar uma técnica capaz de medir a atividade total da GAD, utilizando córtex e hipocampo de ratos. Neste processo, utilizou-se 65 ratos wistar machos (200-300g de peso). Todas as reações foram realizadas sobre as condições de pH 6,4 e temperatura a 37°. O princípio da técnica basea-se na atividade total oxidativa do homogenato, subtraindo-se a oxidação da GAD inibida por penicilinamina. Quatro variáveis foram levadas em consideração, atividade radioativa específica, diluição do tecido, tempo de reação e gradiente de substrato. A menor atividade radioativa específica obtida foi com 0,05 uCi [C-14(U)]Glu, sendo de 0,305 ± 0,022 nmol CO2/mg/h. A melhor condição de diluição para o hipocampo foi 1:20 p/v e para córtex foi 1:10 p/v. O melhor tempo de reação para ambas as estruturas foi de 1h. Vmax e Km aparente foi de 1,252 nmol CO2/mg/h e 25,55, e 0,902 nmol CO2/mg/h e 15,87, para hipocampo e córtex, respectivamente. Nosso estudo demonstrou que é possível obter-se medidas replicáveis e confiáveis da atividade específica da GAD, utilizando-se apenas hipocampo e córtex provenientes de um hemisfério cerebral

Modulações energéticas cerebrais permitem a manutenção de crises epilépticas prolongadas

Epilepsia é uma desordem neurológica que afeta o sistema nervoso central, predispondo o paciente a crises recorrentes, as quais apresentam uma alta demanda energética cerebral, e que culminam na depleção dos níveis de glicose cerebrais conforme a crise epiléptica progride de aguda (até 5 min) à prolongada (de 5 min até algumas horas). A presente tese mapeou os diferentes modelos de crises e síndromes epilépticas com enfoque em peixe-zebra, no intuito de selecionar o melhor modelo em nosso universo experimental para investigar quais outros substratos energéticos poderiam ser utilizados pelo cérebro frente ao hipometabolismo da glicose em crises epilépticas prolongadas induzidas por pentilenotetrazol. Hipotetizou-se um ambiente produtor de peróxido de hidrogênio como agente modulatório do metabolismo energético neste tipo de crise epiléptica. Para tanto se caracterizou o protocolo de respirometria de alta resolução em dissociado cerebral de peixe-zebra adulto. Os peixes foram expostos a pentilenotetrazol por diferentes tempos. Detectou-se um desacoplamento entre o metabolismo da glicose e o consumo de O2 para produção de ATP em crises epilépticas prolongadas de 20 min. Neste momento, testou-se o impacto dos seguintes substratos energéticos sobre o consumo de O2 para produção de ATP: L-glutamato, L-glutamina, L-lactato, e β-hidroxibutirato. Também foi avaliado o sistema pró/antioxidante em amostras de cérebro de peixe-zebra adulto submetido a crises epilépticas prolongadas por 20 min (CEUA – 28043). Os resultados indicam o uso do L-glutamato e da L-glutamina como substratos energéticos para a manutenção de crises epilépticas prolongadas, e um ambiente favorável à produção de peróxido de hidrogênio, pela redução da atividade do Complexo I mitocondrial, pelo aumento da atividade das enzimas superóxido dismutase e glutationa peroxidase, e pelo aumento da oxidação de diclorofluoresceína. A literatura aponta para uma inibição da glicerol-3-fosfato-desidrogenase e piruvato-cinase, e uma ativação da glicose-6-fosfato-desidrogenase por aumento de peróxido de hidrogênio, o que culmina na diminuição da utilização da glicose como substrato energético. A completa oxidação do glutamato na presença de baixos níveis de piruvato ocorre via saída do malato da matriz mitocondrial e sua conversão a piruvato pela enzima málica. Ambas as enzimas produtoras de Fosfato de dinucleótido de nicotinamida e adenina reduzida citadas acimas apresentam atividade aumentada no modelo de convulsão abordado. Portanto, o metabolismo glutamatérgico é fundamental para a manutenção energética, e para a atividade de defesas antioxidantes em momentos de crises epilépticas prolongadas induzidas por pentilenotetrazol em peixe zebra adulto.Epilepsy is a brain disorder, which promotes the predisposition to events of high energy expenditure known as epileptic seizure. As epileptic seizure progress form acute (until 5 min of duration) to prolonged (above 5 min of duration), lower is the concentration of glucose in the brain. This thesis mapped all models of zebrafish epileptic seizure and epileptic syndrome to choose the best model in our experimental conditions to evaluate the impact of other substrates under glucose brain hypometabolism related to prolonged epileptic seizure induced by pentylenetetrazole. It was hypothesized that an environment with high concentrations of hydrogen peroxide could be connecting with the fast metabolic modulation in this model. To do so, the highresolution respirometry protocol for zebrafish brain dissociated was characterized. Fish were exposed to pentylenetetrazole by different duration. There was a decoupling between glucose brain metabolism and O2 consumption to ATP synthesis after 20 min of exposure to pentylenetetrazole. At this moment, the impact of the following substrates were measured under O2 consume to ATP synthesis: L-glutamate, L-glutamine, L-lactate, and β-hydroxybutyrate. The redox balanced was evaluated as well (CEUA – 28043). Data indicate L-glutamate and L-glutamine as the main energy substrate to maintain prolonged epileptic seizure. There was an environment prone to hydrogen peroxide, because mitochondrial complex I activity was impered, and the enzymes superoxide dismutase and glutamine peroxidase were activity, as well as the oxidation of diclorofluoresceine was increased. Hydrogen peroxide activates glucose-6-phosphate-dehydrogenase, and inhibits glycerol-3-phosphatedehydroganase as well as piruvate kinase. Therefore the glucose metabolism would be modulated to antioxidant defense instead of glycolysis. In low pyruvate concentrations, malate from glutamate is transported to the cytosol and converted to pyruvate and Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate. The activity of glucose-6- phosphate-dehydrogenase and citosolic malic enzyme were increased. Therefore, glutamate metabolismo is imperative to energy maintain prolonged epileptic seizure and to antioxidante defense to avoid further damage

Padronização da atividade total da glutamato descarboxilase em cérebro de ratos

O ácido γ-aminobutirico (GABA) é o principal neurotransmissor inibitório do sistema nervoso central (SNC) de mamíferos. A sua síntese é mediante a uma reação catalítica envolvendo a descarboxilação do glutamato através da atividade da glutamato descarboxilase (GAD). O Objetivo deste estudo foi padronizar uma técnica capaz de medir a atividade total da GAD, utilizando córtex e hipocampo de ratos. Neste processo, utilizou-se 65 ratos wistar machos (200-300g de peso). Todas as reações foram realizadas sobre as condições de pH 6,4 e temperatura a 37°. O princípio da técnica basea-se na atividade total oxidativa do homogenato, subtraindo-se a oxidação da GAD inibida por penicilinamina. Quatro variáveis foram levadas em consideração, atividade radioativa específica, diluição do tecido, tempo de reação e gradiente de substrato. A menor atividade radioativa específica obtida foi com 0,05 uCi [C-14(U)]Glu, sendo de 0,305 ± 0,022 nmol CO2/mg/h. A melhor condição de diluição para o hipocampo foi 1:20 p/v e para córtex foi 1:10 p/v. O melhor tempo de reação para ambas as estruturas foi de 1h. Vmax e Km aparente foi de 1,252 nmol CO2/mg/h e 25,55, e 0,902 nmol CO2/mg/h e 15,87, para hipocampo e córtex, respectivamente. Nosso estudo demonstrou que é possível obter-se medidas replicáveis e confiáveis da atividade específica da GAD, utilizando-se apenas hipocampo e córtex provenientes de um hemisfério cerebral

Caracterização comportamental do modelo de convulsões induzidas por pentilenotetrazol em zebrafish adulto

O pentilenotetrazol (PTZ) é um agente convulsivo amplamente utilizado em modelos animais para investigações envolvendo crises convulsivas. Embora haja um crescente número de estudos envolvendo zebrafish adulto e convulsão, não há até o momento uma caracterização comportamental detalhada do modelo de indução de crises por PTZ neste animal. Portanto, o objetivo deste estudo foi realizar uma caracterização detalhada das manifestações comportamentais no modelo de convulsão induzida por PTZ em zebrafish adulto. Grupos de 12 animais foram submetidos, por imersão, a distintas diferentes concentrações de PTZ (5, 7.5, 10 e 15 mM). O comportamento convulsivo foi observado durante 20 minutos. Os animais apresentaram os seguintes escores comportamentais: (0) nados curtos; (1) aumento na atividade natatória e na abertura opercular; (2) movimentos erráticos e acelerados; (3) movimentos circulares; (4) convulsão clônica; (5) convulsão tônica; (6) morte. Os animais expostos a diferentes distintas concentrações de PTZ apresentaram diferentes distintos perfis convulsivos, intensidades de convulsão e latência para chegar aos escores. Apenas os animais imersos na concentração de 15 mM apresentaram maior tempo para retornar ao comportamento normal após a exposição ao PTZ. A mortalidade foi de 33% e 50% para as concentrações de 10 mM e 15 mM, respectivamente. No intuito de avaliar abordagem perfil comportamental frente ao pré-tratamento de um fármaco anticonvulsivo, 12 animais foram expostos a diazepam (DZP) por 40 min e após expostos ao PTZ (10 mM). O tratamento com DZP atenuou a severidade da convulsão, mas não o tempo necessário para retornar ao comportamento normal. Levando em consideração que este modelo baseia-se na imersão direta do animal a uma solução de PTZ, avaliamos também as concentrações cerebrais deste agente convulsivo. Além disso, investigamos também uma possível correlação entre a concentração cerebral de PTZ, o tempo e a concentração de exposição. Os resultados decorrentes da exposição dos animais a 5 e 10 mM de PTZ, apontam para uma correlação tempo e concentração dependentes. Os resultados deste trabalho demonstram uma caracterização comportamental detalhada ao longo do tempo de exposição ao PTZ, além de avaliar pela primeira vez a intensidade de convulsão, tempo de retorno ao comportamento normal e mortalidade dos animais. Além disso, pela primeira vez foram determinadas as concentrações cerebrais deste composto neste modelo de convulsão em zebrafish adulto. Por fim, espera-se que tais ferramentas comportamentais e de quantificação cerebral deste composto possam ser úteis em futuras investigações translacionais e estudos que tenham como objetivo melhor compreender esta desordem.Pentylenetetrazole (PTZ) is a common convulsant agent used in animal models to investigate the mechanisms of seizures. Although adult zebrafish have been recently used to study epileptic seizures, a thorough characterization of the PTZ-induced seizures in this animal model is missing. The goal of this study was to perform a detailed temporal behavior profile characterization of PTZ-induced seizure in adult zebrafish. The behavioral profile during 20 min of PTZ immersion (5, 7.5, 10, and 15 mM) was characterized by stages defined as scores: (0) short swim, (1) increased swimming activity and high frequency of opercular movement, (2) erratic movements, (3) circular movements, (4) clonic seizure-like behavior, (5) fall to the bottom of the tank and tonic seizure-like behavior, (6) death. Animals exposed to distinct PTZ concentrations presented different seizure profiles, intensities and latencies to reach all scores. Only animals immersed into 15 mM PTZ showed an increased time to return to the normal behavior (score 0), after exposure. Total mortality rate at 10 and 15 mM were 33% and 50%, respectively. Considering all behavioral parameters, 5, 7.5, 10, and 15 mM PTZ, induced seizures with low, intermediate, and high severity, respectively. Pretreatment with diazepam (DZP) significantly attenuated seizure severity. Finally, the brain PTZ levels in adult zebrafish immersed into the chemoconvulsant solution at 5 and 10 mM were comparable to those described for the rodent model, with a peak after a 20-min of exposure. The PTZ brain levels observed after 2.5-min PTZ exposure and after 60-min removal from exposure were similar. Altogether, our results showed a detailed temporal behavioral characterization of a PTZ epileptic seizure model in adult zebrafish. These behavioral analyses and the simple method for PTZ quantification could be considered as important tools for future investigations and translational researches