Therapeutic vulnerability of multiple myeloma to MIR17PTi, a first-in-class inhibitor of pri-mir-17-92

The microRNA cluster miR-17-92 is oncogenic and represents a valuable therapeutic target in c-MYC (MYC)-driven malignancies. Here, we developed novel LNA gapmeR antisense oligonucleotides (ASOs) to induce RNase H-mediated degradation of MIR17HG primary transcripts and, consequently, to prevent biogenesis of miR-17-92 microRNAs (miR-17-92s). The leading LNA-ASO, named MIR17PTi, impaired proliferation of several cancer cell lines (n=48) established from both solid and hematologic tumors by on-target antisense activity, and more effectively as compared to miR-17-92s inhibitors. By focusing on multiple myeloma (MM), we found that MIR17PTi triggers apoptosis via impairment of homeostatic MYC/miR-17-92 feed-forward loops (FFLs) in patient-derived MM cells; and induced MYC-dependent synthetic lethality. We show that alteration of a BIM-centered FFL is instrumental for MIR17PTi to induce cytotoxicity in MM cells. MIR17PTi exerts strong in vivo anti-tumor activity in NOD-SCID mice bearing clinically relevant models of MM, with advantageous safety and pharmacokinetics profiles in non-human primates. Altogether, MIR17PTi is a novel pharmacological tool to be tested in early-phase clinical trials against MM and other MYC-driven malignancies

miR-23b/SP1/c-myc forms a feed-forward loop supporting multiple myeloma cell growth

Deregulated microRNA (miR)/transcription factor (TF)-based networks represent a hallmark of cancer. We report here a novel c-Myc/miR-23b/Sp1 feed-forward loop with a critical role in multiple myeloma (MM) and Waldenstrom's macroglobulinemia (WM) cell growth and survival. We have found miR-23b to be downregulated in MM and WM cells especially in the presence of components of the tumor bone marrow milieu. Promoter methylation is one mechanism of miR-23b suppression in myeloma. In gain-of-function studies using miR-23b mimics-transfected or in miR-23b-stably expressing MM and WM cell lines, we observed a significant decrease in cell proliferation and survival, along with induction of caspase-3/7 activity over time, thus supporting a tumor suppressor role for miR-23b. At the molecular level, miR-23b targeted Sp1 3'UTR and significantly reduced Sp1-driven nuclear factor-kappa B activity. Finally, c-Myc, an important oncogenic transcription factor known to stimulate MM cell proliferation, transcriptionally repressed miR-23b. Thus MYC-dependent miR-23b repression in myeloma cells may promote activation of oncogenic Sp1-mediated signaling, representing the first feed-forward loop with critical growth and survival role in myeloma

The apobec mutational activity in multiple myeloma: from diagnosis to cell lines

Next generation sequencing (NGS) studies have highlighted the role of aberrant activity of APOBEC DNA deaminases in generating the mu- tational repertoire of multiple myeloma (MM). However, the contribu- tion of this mutational process across the landscape of plasma cell dyscrasias, or its prognostic role, has never been investigated in detail. To answer these unexplored aspects of MM biology, we used published NGS data from our own work as well as others, including the large CoMMpass trial for a total of 1153 whole-exomes of MM. Furthermore, we investigated 5 MGUS, 6 primary plasma cell leukemias (pPCL) and 18 MM cell lines (MMCL). Overall, we identified signatures of two mu- tational processes, one related to spontaneous deamination of methy- lated cytosines (30% of variants, range 0-100%) and one attributed to aberrant APOBEC activity (70% of variants, range 0-100%). APOBEC contribution was extremely heterogeneous among MM patients, but was correlated with a higher mutational burden (r=0.71, p=<0.0001) and with MAF gene translocations t(14;16) and t(14;20). The activity of APOBEC increased from MGUS to MM to pPCL, both in terms of ab- solute number of mutations and as percentage contribution. In MMCL we instead observed a bi-modal distribution whereby 8 cell lines showed the highest numbers of mutations caused by APOBEC (5/8 car- ried MAF translocations), while 10 where virtually devoid of APOBEC mutations (0/10 carried MAF translocations). The contribution of APOBEC to the total mutational repertoire in MM had a clear prognos- tic impact. MM patients with APOBEC mutations in the lowest quartile had a survival advantage over patients with APOBEC mutations in the highest quartile both in terms of progression-free survival (3-y PFS 46% vs 67% months, p=<0.0001) and overall survival (3-y OS 52% vs 83%, p=0.0084). This association was retained in a multivariate model that included age, gender, cytogenetic class, ISS, and quartiles of mutational load both in PFS [p=0.02, HR 2.06 (95IC 1.11-3.81] and OS [p=0.02, HR 2.88 (95IC 1.17-7.09)]. Interestingly we found that APOBEC mutations in the 4th quartile retained its independent prognostic respect to high mutational load and presence of MAF translocations. Overall, our data suggest that APOBEC-mediated mutagenesis is strongly involved in MM pathogenesis and its activity persists during different phases of evolution, playing a critical role in MM genomic complexity, and im- pacting prognosis of the patients

Standortfaktoren für epiphytische Flechten in einem immissionsgeschädigten Fichten-Tannenwald am Whiteface Mountain, New York

In einem Abies balsamea-Picea rubens-Bestand am Whiteface Mountain im US-Bundesstaat New York wurde die epiphytische Diversität der Flechtenvegetation zwischen gesunden und immissionsgeschädigten Rotfichten (Picea rubens) sowie zwischen Rotfichte und Balsamtanne (Abies balsamea) miteinander verglichen. Die geschädigten Rotfichten sind flechtenreicher als die gesunden und die Balsamtannen sind flechtenreicher als die Rotfichten. Arthonia caesia war die dominante Flechtenart auf lebenden Tannen sowie auf lebenden und toten Fichten. Tote Tannen waren hingegen überwiegend mit Hypogymnia physodes besiedelt.Die Elementgehalte des Stammablaufs und der Borke wurden daraufhin untersucht, ob sie für diese Verbreitungsunterschiede verantwortlich sein könnten. Im Stammablauf lebender Tannen zeigten sich im Vergleich zu den lebenden Fichten höhere Gehalte an P, S, K, Na, Mn, Al und Cu. Lebende Fichten hatten hingegen höhere NO3- und H+ Gehalte im Stammablauf. Eine geringere Assimilationsrate der lebenden Fichten im Vergleich zu den lebenden Tannen könnte für die höheren Mengen an NO3- im Stammablauf der letztgenannten Art verantwortlich sein. NO3-, Ca, Mn, Al und H+ waren höher konzentriert im Stammablauf toter Fichten als im Stammablauf toter Tannen. Konzentrationen der Elemente S, Na, Fe und Al sowie die Leitfähigkeit waren höher im Stammablauf lebender Fichten als die im Stammablauf toter Fichten. Lebende Tannen wiesen höhere Gehalte an Mn und Cu auf als tote. Eine reduzierte Interzeptionsrate, hervorgerufen durch eine geringere Nadelmasse auf den toten als auf den lebenden Bäumen, kann als Hauptgrund für die Elementverteilug angesehen werden. 1999 wurde für NO3- im Stammablauf ein signifikant höherer mittlerer Gehalt auf lebenden als auf toten Rotfichten nachgewiesen; dies traf jedoch nicht für die Tannen zu.Lebende Tannen wiesen höhere Elementkonzentrationen von N, K, Mg, Mn, Zn, Cu und H+ in der Borke auf als lebende Fichten, wohingegen Fe höhere Gehalte in der Borke lebender Fichten aufwies. Ein ähnliches Bild ergab sich für den Vergleich toter Tannen und Fichten, wobei alle Elemente (bis auf Zn) in der Borke der Balsamtannen höher konzentriert waren. Die Bilanz der Elementkonzentration in der Borke wird durch 1) die Ionenaufnahme aus dem Boden, durch 2) die trockene Deposition, durch 3) die Auswaschung von Ionen durch den Stammablauf und 4) durch die Aufnahme von Ionen aus dem Stammablauf beeinflußt. Die Wichtigkeit des Einflusses der einzelnen Faktoren auf die Bilanz hängt vom Element selber und von der Baumart ab. Es kann vermutet werden, daß aufgrund der langsameren Schälung der Tannenborke höhere Elementgehalte erreicht werden als in der Fichte, deren Borke sich deutlich schneller erneuert. Für die Verteilung von Zn kann keine Erklärung gegeben werden.Die meisten Elemente in der Borke unterschieden sich in ihrem Gehalt zwischen toten und lebenden Bäumen. K, Ca, Mg, Mn, Zn und H+ waren im Vergleich zu den lebenden Bäumen in der Borke toter Fichten höher konzentriert, wohingegen lediglich N und Ca in der Borke toter Tannen einen höheren Gehalt aufwiesen. Diese Elementverteilung kann entweder auf einen Einfluß des Stammablaufes oder auf einen Einfluß des Stoffwechsels in den lebenden Untersuchungsbäumen hinweisen.Der Gehalt von NO3- im Stammablauf ist negativ mit der Deckung einer Reihe von Flechtenarten korreliert. ANOVA zeigte den stärksten Einfluß von NO3- auf die Deckung von Flavopunctelia soredica, Hypogymnia physodes, Platismatia glauca und Usnea spec. Zusätzlich zeigten sich bei Flechten der Art Hypogymnia physodes, die mit NO3--Konzentrationen zwischen 100 µmol l-1 und 10 mmol l-1 behandelt wurden, geringere Chlorophyll a- und Chlorophyll b-Gehalte als bei den Kontrollen, wohingegen der Ergosterolgehalt keine Unterschiede aufwies. Das Chlorophyll a : Ergosterol-Verhältnis war verglichen mit den Kontrollen bei den NO3--Varianten geringer.Korrelationen von S, Ca, Mg, Mn und Fe mit der Flechtendeckung waren wahrscheinlich zufällig. ANOVA zeigte keinen signifikanten Einfluß der Elemente Ca, Mg und Fe auf die Flechtendeckung, und S sowie Mn korrelierten nur schwach mit den Arten Micarea prasina und Cladonia coniocraea (im Fall von S) sowie Mycoblastus sanguinarius und Parmelia saxatilis (im Fall von Mn). Kausale Zusammenhänge können in beiden Fällen ausgeschlossen werden: Einige der Flechtenarten kommen auch im Harz bei höheren S- und Mn-Konzentrationen vor. Weiterhin konnte von unserer Arbeitsgruppe durch Inkubationsversuche experimentell gezeigt werden, daß Mn zwar die Soredienkeimung von Hypogymnia physodes negativ beeinflußt, dies aber erst bei höheren Konzentrationen als bei den im Stammablauf des Whiteface Mountain gemessenen.Wie mit Hilfe der Korrelationsanalyse gezeigt werden konnte, waren die Elementkonzentrationen in der Borke (Mn und Fe) von geringer Bedeutung für die Flechtendeckung. Hohe Mn-Gehalte in der Tannenborke, wie sie am Whiteface Mountain nachgewiesen wurden, beeinflussen die Flechten nicht, da das Mn in den Zellen immobilisiert als Kristall vorliegt.Das Mikroklima unterschied sich nicht zwischen den untersuchten Baumarten oder zwischen toten und lebenden Bäumen. Ein Grund kann in dem dichten Tannenjungwuchs gesehen werden, der im Wald am Whiteface Mountain dominiert. Die mikroklimatischen Parameter korrelierten schwach mit einzelnen Flechtenarten. Loxospora ochrophaea korrelierte negativ mit der Evaporation; Bryoria nadvornikiana korrelierte schwach negativ mit der Evaporation und dem Licht. Arthonia caesia kam häufiger auf den Bäumen mit dem niedrigsten Lichteinfall vor als auf Bäumen mit dem höchsten Lichteinfall. Die Deckung der Flechten Bryoria capillaris und B. furcellata, Evernia mesomorpha, Lecidea nylanderi, Pseudevernia consocians sowie Usnea spec. war positiv mit dem Licht korreliert. Aus diesem Ergebnis kann geschlossen werden, daß obwohl das Mikroklima einzelne Arten beeinflußt, ein alleiniger Einfluß der mikroklimatischen Parameter jedoch ausgeschlossen werden kann.Generell kann festgehalten werden, daß die Ergebnisse mit unserer Hypothese übereinstimmen, daß durch eine geringere Nadelmasse auf toten Bäumen eine reduzierte Schadstoffkonzentration auf der Borkenoberfläche erreicht wird, die das Vorkommen einer höher diversen Flechtenvegetation auf toten als auf lebenden Bäumen ermöglicht. Weiterhin besteht die Möglichkeit, daß NO3- einen Einfluß auf die Flechtendeckung besitzt, was die Verbreitungsverhältnisse im untersuchten Bestand erklären könnte. Allerdings kann die Möglichkeit einer geringeren Assimilationsrate lebender Fichten im Vergleich zu den Tannen nicht ausgeschlossen werden, wonach die Epiphyten selbst für die Verteilung der NO3--Konzentration im Stammablauf der Untersuchungsbäume verantwortlich wären. Ein Einfluß des Mikroklimas auf die Flechtenverbreitung kann für einzelne Arten nicht ausgeschlossen werden, wohingegen ein Einfluß des Borkengehaltes eine untergeordnete Rolle spielt

Analysis of mutations and structural variants to redefine the genomic landscape of multiple myeloma and its clinical implications

Introduction: In multiple myeloma (MM), karyotypic events such as translocations between the IGH locus and known oncogenes, and recurrent copy-number abnormalities (CNAs) are considered early drivers, being detectable also in pre-malignant stages of the disease. Recently, several recurrent single-nucleotide-variants (SNVs) have been described in MM, but their real driver role and relationship with other genomic events have never been explored on large series. Methods: Here, we combined whole genome (n=30), whole exome (n=849) and targeted (n=373) sequencing data of 1252 MM patients. Eight hundred and four patients were included from the CoMMpass study, generated as part of the Multiple Myeloma Research Foundation Personalized Medicine Initiatives. The driver vs passenger role of each SNV was defined by the dNdS algorithm (Martincorena et al., Cell 2017). The hierarchical dirichlet (HDP) process was used to investigate the main MM genomic subgroups as previously described (Bolli et al. Leukemia 2017). Figure 1. Results: Combining WGS and 879 whole-exome data, we extracted 56 significant driver SNVs [median of 1 per patient (range 0-6)], with KRAS (23%), NRAS (22.1%), DIS3 (9.5%) and FAM46c (4.8%) confirmed as the most recurrent. At least one driver SNV was extracted in 741 patients (84%). We then included additional 373 MM patients investigated by an unmatched targeted sequencing approach (Bolli et al. Leukemia 2017), to create the largest dataset of MM samples to date (n=1252) to investigate the interrelationships of karyotypic events (n=14) and the most frequent SNVs (n=21). To this end, patterns of co-occurrence and mutual exclusivity of recurrent CNAs and SNVs were derived from their distribution and clustered using the HDP. Karyotypic events contributed to clustering more than SNVs, and we extracted five main clusters based on their extended genotype (Figure 1). The first was defined by hyperdiploidy and accounted for 59% of the entire series. del13q, del TRAF3, gain1q21 and del1p13 defined the second cluster (18%). t(11;14)(CCND1;IGH) and mutated NRAS/KRAS defined the third cluster (11%). del13q, gain 1q21, DIS3 mutation, t(4;14) defined the fourth cluster (5.5%). TP53 mutation, del17p13, del13q14, t(11;14), deletion of CYLD defined the last cluster (4%). With a median followup of 621 (range 31-4205) days, the clusters had a distinct clinical outcome, with cluster 5 showing the poorest overall survival and cluster 3 showing a favorable outcome. Conclusion: Our data show that a tentative genomic classification in MM is dominated by karyotypic events, with driver SNVs occurring during later on distinct genomic profiles. Our analysis showed significant clustering, however most events were not entirely segregated within each group, suggesting a context-dependent effect of many of them, and a role for other genomic non-coding drivers. Our analysis supports the use of extended genotyping of MM cases at diagnosis for classification and prognostication

The Complex Landscape of Rearrangements in Smoldering and Symptomatic Multiple Myeloma Revealed By Whole-Genome Sequencing

INTRODUCTION: Multiple myeloma is a heterogeneous disease featured by recurrent translocations involving the IgH region. Such cytogenetic events have a driver role in early transformation of a normal plasma cell into a MM cell. Although several studies have reported the presence of limited number of other structural chromosomal events using different approaches, including conventional cytogenetics, high-resolution genome mapping, interphase fluorescence in situ hybridization (FISH) and whole exome sequencing, the full catalogue of genomic rearrangements in MM samples has never been carried out systematically. Here, we have utilized whole-genome sequencing technologies to perform a systematic, genome-wide analysis to uncover the frequency and nature of rearrangements in MM. MATERIAL AND METHODS: We performed Whole genome sequencing (WGS) using the Illumina X10 platform in 68 serial samples from 30 patients including 11 patients with smoldering myeloma, 13 newly-diagnosed patients and 44 relapsed patient samples to provide further insight into evolution of rearrangements in MM. Structural variations (translocations, deletions, inversions, internal tandem duplications, fusions) and copy number changes were analyzed using the analysis pipeline at the Wellcome Trust Sanger Institute as recently described (Nik-Zainal Nature 2016). RESULTS: We observed a total of 1295 rearrangements for a median of 27 per sample (range 2-138) including a median of 6 (range 1-36) inversions, 5 (range 1-33) internal tandem duplications, 10 (range 1-40) deletions, 7 (range 1-32) translocations and 5 fusions (0-20). While the vast majority of events was non-recurrent, the high prevalence of rearrangements at smoldering stage and in myeloma at diagnosis and further increase at the time of relapse suggest a much more complex genomic landscape than previously thought. Translocations involving the IGH locus were identified including t(11;14) in 6 (20%), t(4;14) in 4 (13%) and t(8;14) in 3 (10%) of 30 unique patients. We also report frequent involvement by light chain loci in the rearrangements. The MYC locus was recurrently affected by non-IGH rearrangements in 11/30 (36%) patients. The other main MYC partners were IGL (4/30) and IGK (2/30), while about one-third of cases were involved by rearrangements not involving immunoglobulins or other obvious partners. MYC is therefore frequently involved by rearrangements through immunoglobulin-independent mechanisms. Interestingly, many regions affected by recurrent copy number abnormalities (CNAs) were associated with rearrangements. In particular 7/14 (50%) 1q gains and 6/8 (75%) 1p deletions were involved by translocations and inversions respectively (i.e Figure 1a). Overall 15/22 chromosome 1 CNAs were associated with a specific rearrangements. A similar association between copy number changes and rearrangement breakpoints was observed among other recurrent genomic aberrations such as 6q deletions (6/12, 50%), 8p deletions (4/7, 57%) and 16q deletions (7/13, 53%). In addition to deletions, inversions, internal tandem duplications (ITDs) and translocations, we observed at least one and often more regions of chromothripsis in 10/30 (33%) patients. Chromothripsis represents a complex event characterized by localized chromosome shattering and repair occurring in a one-off catastrophic event (Korbel J. et al. Cell 2013) (Figure 1b) and known to be associated with worse prognosis in MM. In our series, chromothriptic events were always conserved during every investigated evolution process: suggesting an early onset of this complex event in myelomagenesis. CONCLUSION: We report for the first time a comprehensive catalogue of rearrangements in MM based on whole-genome sequencing data. Our data provide evidence that the genomic landscape of rearrangements in MM is very complex and heterogeneous than speculated before and besides IgH involves number of other recurrent chromosomal alteration mechanisms. These diverse aberrations, in many cases acquired early, may deregulate oncogenes as illustrated by the MYC locus