Monocytes of patients with familial hypercholesterolemia show alterations in cholesterol metabolism

<p>Abstract</p> <p>Background</p> <p>Elevated plasma cholesterol promotes the formation of atherosclerotic lesions in which monocyte-derived lipid-laden macrophages are frequently found. To analyze, if circulating monocytes already show increased lipid content and differences in lipoprotein metabolism, we compared monocytes from patients with Familial Hypercholesterolemia (FH) with those from healthy individuals.</p> <p>Methods</p> <p>Cholesterol and oxidized cholesterol metabolite serum levels of FH and of healthy, gender/age matched control subjects were measured by combined gas chromatography – mass spectroscopy. Monocytes from patients with FH and from healthy subjects were isolated by antibody-assisted density centrifugation. Gene expression profiles of isolated monocytes were measured using Affymetrix HG-U 133 Plus 2.0 microarrays. We compared monocyte gene expression profiles from FH patients with healthy controls using a Welch T-test with correction for multiple testing (p < 0.05; Benjamini Hochberg correction, False Discovery Rate = 0.05). The differential expression of FH associated genes was validated at the mRNA level by qRT-PCR and/or at the protein level by Western Blot or flow cytometry. Functional validation of monocyte scavenger receptor activities were done by binding assays and dose/time dependent uptake analysis using native and oxidized LDL.</p> <p>Results</p> <p>Using microarray analysis we found in FH patients a significant up-regulation of 1,617 genes and a down-regulation of 701 genes compared to monocytes from healthy individuals. These include genes of proteins that are involved in the uptake, biosynthesis, disposition, and cellular efflux of cholesterol. In addition, plasma from FH patients contains elevated amounts of sterols and oxysterols. An increased uptake of oxidized as well as of native LDL by FH monocytes combined with a down-regulation of NPC1 and ABCA1 explains the lipid accumulation observed in these cells.</p> <p>Conclusion</p> <p>Our data demonstrate that circulating FH monocytes show differences in cell physiology that may contribute to the early onset of atherosclerosis in this disease.</p

Funktionelle Charakterisierung neu identifizierter Defekte desLDL-Rezeptors und von Apolipoprotein B-100

Die Atherosklerose und ihre Folgeerkrankungen, insbesondere die koronare Herzkrankung (KHK) ist in den westlichen Industrienationen für die Mehrheit der Todesfälle verantwortlich. In großen epidemiologischen Studien konnte die Bedeutung der Hypercholesterinämie als kardiovaskulärer Risikofaktor aufgezeigt werden. Die familiäre Hypercholesterinämie (FH) ist eine monogenetisch autosomal dominant vererbte Lipidstoffwechselstörung, die in homozygoter Ausprägung zu schwerstmanifesten Formen einer Atherosklerose führt. Bei betroffenen Patienten kommt es ohne medizinische Intervention bereits in der ersten Lebensdekade zu einem frühzeitigen Tod durch Myokardinfarkt oder Schlaganfall. Die Ursachen von FH sind Mutationen in den Genen des LDL-Rezeptors und dessen Ligand ApoB-100, die zu einem Plasmaanstieg von atherogenen LDL-Partikeln führen. In der vorliegenden Arbeit wurden in einer DGGE- basierten Mutationsstudie mit Patienten aus dem Kollektiv der Marburger Präventions-Allianz zwei neue Defekte des LDL-Rezeptors (W556R) und von ApoB-100 (H3543Y) identifiziert und detailliert funktionell charakterisiert. Diese Untersuchungen konnten zeigen, dass ApoB-H3543Y mit 1: 223 eine sehr hohe Prävalenz in der deutschen Population aufweist und häufiger vorkommt als alle bisher publizierten ApoB- Mutationen. Strukturell kommt es bei ApoB-H3543Y genau wie bei den anderen ApoB-Defekten mit reduzierter LDL-Rezeptorbindung zur Substitution einer positiv geladenen Aminosäure (H) durch eine neutrale Aminosäure (Y) im carboxyterminalen Modulatorelement der LDLR-Bindungsstelle von ApoB-100. Bindungs- und Aufnahmestudien mit fluoreszenzmarkiertem DiI- ApoB-H3543Y LDL in HeLa-Zellen zeigten eine reduzierte Bindung an und Aufnahme über den LDLR (-31% bzw. 35% der Norm). In vivo Kinetikuntersuchungen zum Turnover von ApoB-H3543Y LDL ermittelten , wie für die FDB-R3500Q-Mutation bereits vorbeschrieben, einen verlangsamten ApoB-H3543Y LDL Katabolismus. Diese Daten konnten klar zeigen, dass es sich bei ApoB-H3543Y um einen neuen Defekt mit funktioneller Relevanz handelt. Neben ApoB-H3543Y konnte im Rahmen dieser Arbeit weltweit erstmals die LDL-Rezeptor-Mutation (W556R) in homozygoter Form bei einer Familie mit 3-jährigen eineiigen männlichen Zwillingen identifiziert werden. Diese Mutation konnte dann ein zweites Mal in homozygoter Form bei einem 4-jährigen Mädchen aus einer nicht verwandten FH-Familie aus dem Libanon nachgewiesen werden. Phänotypisch zeigte sich eine geschlechtsspezifische heterogene Ausprägung der W556R-Mutation (weibliche Mutationsträger hatten deutlich niedrigere LDL- und höhere HDL-Spiegel). Die LDLR-W556R-Mutation betrifft das fünfte hochkonservierte YWVD- Repeat des six bladed ß-Propeller- Motif im LDLR und führt zu einer kompletten zellulären LDLR-Defizienz. Aufnahme und Bindungsstudien mit DiI-LDL in Fibroblasten von homozygoten Patienten zeigten keine nachweisbare DiI-LDL- Bindung/Aufnahme mehr (< 5%). Bei heterozygoten Patienten lagen LDL-Bindung und Aufnahme bei 45% bzw. 49% der Norm. Experimente mit konfokaler Mikroskopie und Western- Blotting identifizierten einen Transportdefekt Klasse 2a mit kompletter LDLR-Retention im Endoplasmatischen Retikulum als molekulare Ursache der W556R-Mutation. Real-Time PCR-Untersuchungen zur Auswirkung von W556R auf die Regulation der intrazellulären Cholesterinbiosynthese ermittelten eine stark erhöhte Expression zentraler Gene des Cholesterinstoffwechsels, die hauptsächlich über den SREBP-2 (Sterol regulatory element-binding protein 2) Transkriptionsfaktor vermittelt wurde. Zusätzlich fanden sich erhöhte mRNA-und Proteinspiegel von SCARB1 (Scavenger-receptor-type- B-I) in Fibroblasten von homozygoten und heterozygoten W556R- Patienten, was auf einen nicht endozytotischen kollateralen Pathway zur direkten Aufnahme von Cholesterin aus HDL und nativen LDL bei FH-W556R via SCARB1 hinweist. Im Gegensatz dazu zeigte sich eine stark reduzierte Genexpression des zellulären Cholesterintransporters ABCA1 in homozygoten, aber nicht in heterozygoten Fibroblasten, die abhängig von der Menge an intrazellulären ABCA1-LXR-Liganden zu sein scheint. Wie bei ApoB-H3543Y fand sich in der in vivo Kinetik-Untersuchung eines FH-W556R-Patienten eine deutlich erhöhte LDL- Plasmaverweildauer.Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass ApoB-H3543Y und LDLR-W556R häufig vorkommende, funktionell relevante Mutationen sind und es geschlechtsspezifische Faktoren gibt, die trotz des Vorliegens einer identischen LDLR-Mutation zu einer unterschiedlich starken Expression des Phänotyps führen. Die Erforschung der zugrundeliegenden Mechanismen bietet ein hohes Potenzial für zukünftige Therapieansätze der homozygoten familiären Hypercholesterinämie, für die es bis zum heutigen Zeitpunkt trotz der enormen Fortschritte in der molekularen Medizin leider immer noch keine adäquate medikamentöse Therapie gibt

Funktionelle Charakterisierung neu identifizierter Defekte desLDL-Rezeptors und von Apolipoprotein B-100

Die Atherosklerose und ihre Folgeerkrankungen, insbesondere die koronare Herzkrankung (KHK) ist in den westlichen Industrienationen für die Mehrheit der Todesfälle verantwortlich. In großen epidemiologischen Studien konnte die Bedeutung der Hypercholesterinämie als kardiovaskulärer Risikofaktor aufgezeigt werden. Die familiäre Hypercholesterinämie (FH) ist eine monogenetisch autosomal dominant vererbte Lipidstoffwechselstörung, die in homozygoter Ausprägung zu schwerstmanifesten Formen einer Atherosklerose führt. Bei betroffenen Patienten kommt es ohne medizinische Intervention bereits in der ersten Lebensdekade zu einem frühzeitigen Tod durch Myokardinfarkt oder Schlaganfall. Die Ursachen von FH sind Mutationen in den Genen des LDL-Rezeptors und dessen Ligand ApoB-100, die zu einem Plasmaanstieg von atherogenen LDL-Partikeln führen. In der vorliegenden Arbeit wurden in einer DGGE- basierten Mutationsstudie mit Patienten aus dem Kollektiv der Marburger Präventions-Allianz zwei neue Defekte des LDL-Rezeptors (W556R) und von ApoB-100 (H3543Y) identifiziert und detailliert funktionell charakterisiert. Diese Untersuchungen konnten zeigen, dass ApoB-H3543Y mit 1: 223 eine sehr hohe Prävalenz in der deutschen Population aufweist und häufiger vorkommt als alle bisher publizierten ApoB- Mutationen. Strukturell kommt es bei ApoB-H3543Y genau wie bei den anderen ApoB-Defekten mit reduzierter LDL-Rezeptorbindung zur Substitution einer positiv geladenen Aminosäure (H) durch eine neutrale Aminosäure (Y) im carboxyterminalen Modulatorelement der LDLR-Bindungsstelle von ApoB-100. Bindungs- und Aufnahmestudien mit fluoreszenzmarkiertem DiI- ApoB-H3543Y LDL in HeLa-Zellen zeigten eine reduzierte Bindung an und Aufnahme über den LDLR (-31% bzw. 35% der Norm). In vivo Kinetikuntersuchungen zum Turnover von ApoB-H3543Y LDL ermittelten , wie für die FDB-R3500Q-Mutation bereits vorbeschrieben, einen verlangsamten ApoB-H3543Y LDL Katabolismus. Diese Daten konnten klar zeigen, dass es sich bei ApoB-H3543Y um einen neuen Defekt mit funktioneller Relevanz handelt. Neben ApoB-H3543Y konnte im Rahmen dieser Arbeit weltweit erstmals die LDL-Rezeptor-Mutation (W556R) in homozygoter Form bei einer Familie mit 3-jährigen eineiigen männlichen Zwillingen identifiziert werden. Diese Mutation konnte dann ein zweites Mal in homozygoter Form bei einem 4-jährigen Mädchen aus einer nicht verwandten FH-Familie aus dem Libanon nachgewiesen werden. Phänotypisch zeigte sich eine geschlechtsspezifische heterogene Ausprägung der W556R-Mutation (weibliche Mutationsträger hatten deutlich niedrigere LDL- und höhere HDL-Spiegel). Die LDLR-W556R-Mutation betrifft das fünfte hochkonservierte YWVD- Repeat des six bladed ß-Propeller- Motif im LDLR und führt zu einer kompletten zellulären LDLR-Defizienz. Aufnahme und Bindungsstudien mit DiI-LDL in Fibroblasten von homozygoten Patienten zeigten keine nachweisbare DiI-LDL- Bindung/Aufnahme mehr (< 5%). Bei heterozygoten Patienten lagen LDL-Bindung und Aufnahme bei 45% bzw. 49% der Norm. Experimente mit konfokaler Mikroskopie und Western- Blotting identifizierten einen Transportdefekt Klasse 2a mit kompletter LDLR-Retention im Endoplasmatischen Retikulum als molekulare Ursache der W556R-Mutation. Real-Time PCR-Untersuchungen zur Auswirkung von W556R auf die Regulation der intrazellulären Cholesterinbiosynthese ermittelten eine stark erhöhte Expression zentraler Gene des Cholesterinstoffwechsels, die hauptsächlich über den SREBP-2 (Sterol regulatory element-binding protein 2) Transkriptionsfaktor vermittelt wurde. Zusätzlich fanden sich erhöhte mRNA-und Proteinspiegel von SCARB1 (Scavenger-receptor-type- B-I) in Fibroblasten von homozygoten und heterozygoten W556R- Patienten, was auf einen nicht endozytotischen kollateralen Pathway zur direkten Aufnahme von Cholesterin aus HDL und nativen LDL bei FH-W556R via SCARB1 hinweist. Im Gegensatz dazu zeigte sich eine stark reduzierte Genexpression des zellulären Cholesterintransporters ABCA1 in homozygoten, aber nicht in heterozygoten Fibroblasten, die abhängig von der Menge an intrazellulären ABCA1-LXR-Liganden zu sein scheint. Wie bei ApoB-H3543Y fand sich in der in vivo Kinetik-Untersuchung eines FH-W556R-Patienten eine deutlich erhöhte LDL- Plasmaverweildauer.Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass ApoB-H3543Y und LDLR-W556R häufig vorkommende, funktionell relevante Mutationen sind und es geschlechtsspezifische Faktoren gibt, die trotz des Vorliegens einer identischen LDLR-Mutation zu einer unterschiedlich starken Expression des Phänotyps führen. Die Erforschung der zugrundeliegenden Mechanismen bietet ein hohes Potenzial für zukünftige Therapieansätze der homozygoten familiären Hypercholesterinämie, für die es bis zum heutigen Zeitpunkt trotz der enormen Fortschritte in der molekularen Medizin leider immer noch keine adäquate medikamentöse Therapie gibt

Targeting the High-Density Lipoprotein Proteome for the Treatment of Post-Acute Sequelae of SARS-CoV-2

Here, we target the high-density lipoprotein (HDL) proteome in a case series of 16 patients with post-COVID-19 symptoms treated with HMG-Co-A reductase inhibitors (statin) plus angiotensin II type 1 receptor blockers (ARBs) for 6 weeks. Patients suffering from persistent symptoms (post-acute sequelae) after serologically confirmed SARS-CoV-2 infection (post-COVID-19 syndrome, PCS, n = 8) or following SARS-CoV-2 vaccination (PVS, n = 8) were included. Asymptomatic subjects with corresponding serological findings served as healthy controls (n = 8/8). HDL was isolated using dextran sulfate precipitation and the HDL proteome of all study participants was analyzed quantitatively by mass spectrometry. Clinical symptoms were assessed using questionnaires before and after therapy. The inflammatory potential of the patients’ HDL proteome was addressed in human endothelial cells. The HDL proteome of patients with PCS and PVS showed no significant differences; however, compared to controls, the HDL from PVS/PCS patients displayed significant alterations involving hemoglobin, cytoskeletal proteins (MYL6, TLN1, PARVB, TPM4, FLNA), and amyloid precursor protein. Gene Ontology Biological Process (GOBP) enrichment analysis identified hemostasis, peptidase, and lipoprotein regulation pathways to be involved. Treatment of PVS/PCS patients with statins plus ARBs improved the patients’ clinical symptoms. After therapy, three proteins were significantly increased (FAM3C, AT6AP2, ADAM10; FDR < 0.05) in the HDL proteome from patients with PVS/PCS. Exposure of human endothelial cells with the HDL proteome from treated PVS/PCS patients revealed reduced inflammatory cytokine and adhesion molecule expression. Thus, HDL proteome analysis from PVS/PCS patients enables a deeper insight into the underlying disease mechanisms, pointing to significant involvement in metabolic and signaling disturbances. Treatment with statins plus ARBs improved clinical symptoms and reduced the inflammatory potential of the HDL proteome. These observations may guide future therapeutic strategies for PVS/PCS patients

Deficiency of Nucleotide-binding oligomerization domain-containing proteins (NOD) 1 and 2 reduces atherosclerosis

Atherosclerosis is crucially fueled by inflammatory pathways including pattern recognition receptor (PRR)-related signaling of the innate immune system. Currently, the impact of the cytoplasmic PRRs nucleotide-binding oligomerization domain-containing protein (NOD) 1 and 2 is incompletely characterized. We, therefore, generated Nod1/Nod2 double knockout mice on a low-density lipoprotein receptor (Ldlr)-deficient background (= Ldl