Functional and structural characterization of an endo-β-1,3-glucanase from Euglena gracilis

Endo-β-1,3-glucanases from several organisms have attracted much attention in recent years because of their capability for in vitro degrading β-1,3-glucan as a critical step for both biofuels production and short-chain oligosaccharides synthesis. In this study, we biochemically characterized a putative endo-β-1,3-glucanase (EgrGH64) belonging to the family GH64 from the single-cell protist Euglena gracilis. The gene coding for the enzyme was heterologously expressed in a prokaryotic expression system supplemented with 3% (v/v) ethanol to optimize the recombinant protein right folding. Thus, the produced enzyme was highly purified by immobilized-metal affinity and gel filtration chromatography. The enzymatic study demonstrated that EgrGH64 could hydrolyze laminarin (KM 23.5 mg ml−1,kcat 1.20 s−1) and also, but with less enzymatic efficiency, paramylon (KM 20.2 mg ml−1,kcat 0.23 ml mg−1 s−1). The major product of the hydrolysis of both substrates was laminaripentaose. The enzyme could also use ramified β-glucan from the baker's yeast cell wall as a substrate (KM 2.10 mg ml−1, kcat 0.88 ml mg−1 s−1). This latter result, combined with interfacial kinetic analysis evidenced a protein's greater efficiency for the yeast polysaccharide, and a higher number of hydrolysis sites in the β-1,3/β-1,6-glucan. Concurrently, the enzyme efficiently inhibited the fungal growth when used at 1.0 mg/mL (15.4 μM). This study contributes to assigning a correct function and determining the enzymatic specificity of EgrGH64, which emerges as a relevant biotechnological tool for processing β-glucans.Fil: Calloni, Rodrigo Daniel. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Santa Fe. Instituto de Agrobiotecnología del Litoral. Universidad Nacional del Litoral. Instituto de Agrobiotecnología del Litoral; Argentina. Universidad Nacional del Litoral. Facultad de Bioquímica y Ciencias Biológicas; ArgentinaFil: Muchut, Robertino José. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Santa Fe. Instituto de Agrobiotecnología del Litoral. Universidad Nacional del Litoral. Instituto de Agrobiotecnología del Litoral; Argentina. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Centro Regional Santa Fe. Estación Experimental Agropecuaria Reconquista; ArgentinaFil: Garay, Alberto Sergio. Universidad Nacional del Litoral. Facultad de Bioquímica y Ciencias Biológicas; ArgentinaFil: Arias, Diego Gustavo. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Santa Fe. Instituto de Agrobiotecnología del Litoral. Universidad Nacional del Litoral. Instituto de Agrobiotecnología del Litoral; ArgentinaFil: Iglesias, Alberto Alvaro. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Santa Fe. Instituto de Agrobiotecnología del Litoral. Universidad Nacional del Litoral. Instituto de Agrobiotecnología del Litoral; Argentina. Universidad Nacional del Litoral. Facultad de Bioquímica y Ciencias Biológicas; ArgentinaFil: Guerrero, Sergio Adrian. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Santa Fe. Instituto de Agrobiotecnología del Litoral. Universidad Nacional del Litoral. Instituto de Agrobiotecnología del Litoral; Argentina. Universidad Nacional del Litoral. Facultad de Bioquímica y Ciencias Biológicas; Argentin

Heterologous expression and kinetic characterization of the α β and αβ blend of the PPi-dependent phosphofructokinase from Citrus sinensis

This work reports the molecular cloning and heterologous expression of the genes coding for α and β subunits of pyrophosphate-dependent phosphofructokinase (PPi-PFK) from orange. When expressed individually, both recombinant subunits were produced as highly purified monomeric proteins able to phosphorylate fructose-6-phosphate at the expenses of PPi (specific activity of 0.075 and 0.017 units. mg −1 for α and β subunits, respectively). On the other hand, co-expression rendered a α 3 β 3 hexamer with specific activity three orders of magnitude higher than the single subunits. All the conformations of the enzyme were characterized with respect to its kinetic properties and sensitivity to the regulator fructose-2,6-bisphosphate. A thorough review of current knowledge on the matter indicates that this is the first report of the recombinant production of active plant PPi-PFK and the characterization of its different conformations. This is a main contribution for future studies focused to better understand the enzyme properties and how it accomplishes its relevant role in plant metabolism.Fil: Muchut, Robertino José. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Santa Fe. Instituto de Agrobiotecnología del Litoral. Universidad Nacional del Litoral. Instituto de Agrobiotecnología del Litoral; ArgentinaFil: Piattoni, Claudia Vanesa. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Santa Fe. Instituto de Agrobiotecnología del Litoral. Universidad Nacional del Litoral. Instituto de Agrobiotecnología del Litoral; ArgentinaFil: Margarit, Ezequiel. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Rosario. Centro de Estudios Fotosintéticos y Bioquímicos. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Centro de Estudios Fotosintéticos y Bioquímicos; ArgentinaFil: Tripodi, Karina Eva Josefina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Rosario. Centro de Estudios Fotosintéticos y Bioquímicos. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Centro de Estudios Fotosintéticos y Bioquímicos; ArgentinaFil: Podesta, Florencio Esteban. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Rosario. Centro de Estudios Fotosintéticos y Bioquímicos. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Centro de Estudios Fotosintéticos y Bioquímicos; ArgentinaFil: Iglesias, Alberto Alvaro. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Santa Fe. Instituto de Agrobiotecnología del Litoral. Universidad Nacional del Litoral. Instituto de Agrobiotecnología del Litoral; Argentin

Fitopatología molecular aplicada al algodón y al mejoramiento genético del cultivo

Diversos microorganismos patógenos atacan al cultivo de algodón a lo largo de todo su estadio de crecimiento y desarrollo. Entre ellos, figuran diversos hongos, virus y bacterias, que provocan manchas foliares y defoliación temprana, pérdidas de retención de frutos, inhibición del correcto desarrollo, podredumbre y caída de bochas, entre otros. Dichos patógenos, si no son manejados a través de estrategias de prevención, control y sanidad adecuadas, pueden repercutir severamente en la rentabilidad del cultivo.EEA ReconquistaFil: Lorenzini, Fernando. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Estación Experimental Agropecuaria Reconquista; ArgentinaFil: Dileo, Pablo Nahuel. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Estación Experimental Agropecuaria Reconquista; ArgentinaFil: Scarpin, Gonzalo Joel. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Estación Experimental Agropecuaria Reconquista; ArgentinaFil: Winkler, Horacio Martín. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Estación Experimental Agropecuaria Reconquista; ArgentinaFil: Cereijo, Antonela Estefanía. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Estación Experimental Agropecuaria Reconquista; ArgentinaFil: Muchut, Robertino José. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Estación Experimental Agropecuaria Reconquista; ArgentinaFil: Paytas, Marcelo Javier. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Estación Experimental Agropecuaria Reconquista; ArgentinaFil: Roeschlin, Roxana Andrea. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Estación Experimental Agropecuaria Reconquista; Argentin

Los primeros pasos en el desarrollo de nuevas variedades de algodón

En comparación con otros cultivos agrícolas y con otros países productores de algodón, hoy en día en nuestro país contamos con un bajo abanico de variedades disponibles comercialmente para el productor. Este es uno de los principales puntos críticos en su producción, que lo pone en desventaja y que nos lleva a poner en marcha un programa de mejoramiento genético para abordar esta problemática.EEA ReconquistaFil: Dileo, Pablo Nahuel. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Estación Experimental Agropecuaria Reconquista; ArgentinaFil: Winkler, Horacio. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Estación Experimental Agropecuaria Reconquista; ArgentinaFil: Cereijo, Antonela Estefanía. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Estación Experimental Agropecuaria Reconquista; ArgentinaFil: Muchut, Robertino José. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Estación Experimental Agropecuaria Reconquista; ArgentinaFil: Scarpin, Gonzalo Joel. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Estación Experimental Agropecuaria Reconquista; ArgentinaFil: Lorenzini, Fernando. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Estación Experimental Agropecuaria Reconquista; ArgentinaFil: Roeschlin, Roxana Andrea. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Estación Experimental Agropecuaria Reconquista; ArgentinaFil: Paytas, Marcelo Javier. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Estación Experimental Agropecuaria Reconquista; Argentin

Bacteriosis del algodón. Caracterización molecular del agente causal de la mancha angular del algodón en el norte de Santa Fe

La bacteriosis o Mancha Angular del algodón (MAA) es una enfermedad causada por la bacteria Xanthomonas citri subsp. malvacearum (Xcm), que se encuentra distribuida en todas las zonas productoras de algodón del mundo, causando importantes pérdidas del rendimiento en cultivares susceptibles a la enfermedad. El patógeno es capaz de enfermar a la planta de algodón en cualquier estadio de su desarrollo, y produce diferentes sintomatologías según el órgano vegetal afectado: MAA y necrosis de nervaduras en hojas y brácteas, brazo negro en tallos y ramas, además de lesión y podredumbre de cápsulasEEA ReconquistaFil: Lorenzini, Fernando. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Estación Experimental Agropecuaria Reconquista; ArgentinaFil: Dileo, Pablo Nahuel. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Estación Experimental Agropecuaria Reconquista; ArgentinaFil: Winkler, Horacio Martín. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Estación Experimental Agropecuaria Reconquista; ArgentinaFil: Scarpin, Gonzalo Joel. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Estación Experimental Agropecuaria Reconquista; ArgentinaFil: Muchut, Robertino José. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Estación Experimental Agropecuaria Reconquista; ArgentinaFil: Cereijo, Antonela Estefanía. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Estación Experimental Agropecuaria Reconquista; ArgentinaFil: Paytas, Marcelo Javier. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Estación Experimental Agropecuaria Reconquista; ArgentinaFil: Roeschlin, Roxana Andrea. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Estación Experimental Agropecuaria Reconquista; Argentin

Mutagénesis como técnica en la búsqueda de variabilidad genética

Las técnicas de mutagénesis o inducción de mutaciones en plantas son técnicas muy utilizadas por los fitomejoradores con el objetivo de generar diversidad genética. Esta diversidad puede afectar diversos caracteres de utilidad agronómica como: el rendimiento, la calidad, la resistencia a plagas y enfermedades, y la tolerancia a estreses abióticos, como el estrés hídrico y la salinidad, y además, la tolerancia a herbicidas. El estudio de las técnicas de mutaciones inducidas en plantas comenzó en la década de 1920 y el primer logro comercial fue en 1936. Hoy en día existen más de 3275 cultivares mutantes liberados oficialmente en más de 220 especies de cultivos en todo el mundo (http://mvd.iaea.org/). La seguridad alimentaria mundial sigue estando amenazada en particular por el cambio climático, la falta de tierras agrícolas y una población humana en crecimiento. Por lo tanto, existe una presión continua sobre los fitomejoradores para desarrollar cultivares de mayor rendimiento y adaptados a diversos ambientes. En este contexto, el mejoramiento por medio de las técnicas de mutaciones inducidas puede ayudar a satisfacer estas demandas; fundamentándose en el aprovechamiento no sólo de la variabilidad genética espontánea, sino también de la enorme variabilidad genética que puede generarse mediante esta técnicaFil: Winkler, Horacio Martín. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Centro Regional Santa Fe. Estación Experimental Agropecuaria Reconquista; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Santa Fe; ArgentinaFil: Cereijo, Antonela Estefanía. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Santa Fe; Argentina. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Centro Regional Santa Fe. Estación Experimental Agropecuaria Reconquista; ArgentinaFil: Muchut, Robertino José. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Santa Fe; Argentina. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Centro Regional Santa Fe. Estación Experimental Agropecuaria Reconquista; ArgentinaFil: Dileo, Pablo Nahuel. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Centro Regional Santa Fe. Estación Experimental Agropecuaria Reconquista; ArgentinaFil: Scarpin, Gonzalo Joel. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Centro Regional Santa Fe. Estación Experimental Agropecuaria Reconquista; ArgentinaFil: Lorenzini, Fernando Gabriel. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Santa Fe; Argentina. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Centro Regional Santa Fe. Estación Experimental Agropecuaria Reconquista; ArgentinaFil: Roeschlin, Roxana Andrea. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Santa Fe; Argentina. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Centro Regional Santa Fe. Estación Experimental Agropecuaria Reconquista; ArgentinaFil: Paytas, Marcelo Javier. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Centro Regional Santa Fe. Estación Experimental Agropecuaria Reconquista; ArgentinaFil: Landau, Alejandra Mabel. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Centro de Investigación en Ciencias Veterinarias y Agronómicas. Instituto de Genética; Argentin

Desarrollo de una población con variabilidad genética para la selección de genotipos con características agronómicas superiores con la asistencia de marcadores moleculares

En Argentina, las variedades de cultivo de algodón disponibles en el mercado presentan valores de rendimiento de fibra al desmote que van desde 36% a 41%. Esta característica surge de la relación de cantidad de fibra de algodón obtenida en el proceso de desmote y la cantidad de algodón bruto (fibra + semilla) que ingresa a la desmotadora, expresado en porcentaje. Estos rendimientos resultan bajos si se los compara con variedades de otros países productores de algodón como por ejemplo Australia, en los que sus cultivares presentan valores siempre superiores a 40%. En este contexto, es necesario propiciar el desarrollo de nuevos genotipos adaptados a las condiciones del Norte de Santa Fe, con mejoras en el rendimiento de fibra al desmote, manteniendo la calidad. Actualmente, desde INTA Reconquista se viene trabajando con diferentes líneas de investigación que proponen combinar estrategias de selección de mejoramiento convencional con técnicas de biotecnología, entre ellas, la de selección asistida por marcadores moleculares.Fil: Dileo, Pablo Nahuel. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Centro Regional Santa Fe. Estación Experimental Agropecuaria Reconquista; ArgentinaFil: Winkler, Horacio Martín. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Santa Fe; Argentina. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Centro Regional Santa Fe. Estación Experimental Agropecuaria Reconquista; ArgentinaFil: Cereijo, Antonela Estefanía. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Santa Fe; Argentina. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Centro Regional Santa Fe. Estación Experimental Agropecuaria Reconquista; ArgentinaFil: Muchut, Robertino José. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Santa Fe; Argentina. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Centro Regional Santa Fe. Estación Experimental Agropecuaria Reconquista; ArgentinaFil: Scarpin, Gonzalo Joel. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Centro Regional Santa Fe. Estación Experimental Agropecuaria Reconquista; ArgentinaFil: Lorenzini, Fernando Gabriel. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Santa Fe; Argentina. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Centro Regional Santa Fe. Estación Experimental Agropecuaria Reconquista; ArgentinaFil: Roeschlin, Roxana Andrea. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Santa Fe; Argentina. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Centro Regional Santa Fe. Estación Experimental Agropecuaria Reconquista; ArgentinaFil: Paytas, Marcelo Javier. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Centro Regional Santa Fe. Estación Experimental Agropecuaria Reconquista; ArgentinaFil: Rodríguez, Gustavo Rubén. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Agrarias; Argentin

Desarrollo de una población con variabilidad genética para la selección de genotipos. con características agronómicas superiores con la asistencia de marcadores moleculares

En Argentina, las variedades de cultivo de algodón disponibles en el mercado presentan valores de rendimiento de fibra al desmote que van desde 36% a 41%. Esta característica surge de la relación de cantidad de fibra de algodón obtenida en el proceso de desmote y la cantidad de algodón bruto (fibra + semilla) que ingresa a la desmotadora, expresado en porcentaje. Estos rendimientos resultan bajos si se los compara con variedades de otros países productores de algodón como por ejemplo Australia, en los que sus cultivares presentan valores siempre superiores a 40%.EEA ReconquistaFil: Dileo, Pablo Nahuel. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Estación Experimental Agropecuaria Reconquista; ArgentinaFil: Muchut, Robertino José. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Estación Experimental Agropecuaria Reconquista; ArgentinaFil: Winkler, Horacio Martín. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Estación Experimental Agropecuaria Reconquista; ArgentinaFil: Cereijo, Antonela Estefanía. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Estación Experimental Agropecuaria Reconquista; ArgentinaFil: Scarpin, Gonzalo Joel. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Estación Experimental Agropecuaria Reconquista; ArgentinaFil: Lorenzini, Fernando. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Estación Experimental Agropecuaria Reconquista; ArgentinaFil: Roeschlin, Roxana Andrea. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Estación Experimental Agropecuaria Reconquista; ArgentinaFil: Paytas, Marcelo Javier. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Estación Experimental Agropecuaria Reconquista; ArgentinaFil: Rodríguez, Gustavo Rubén. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Agrarias; Argentin

Elucidating carbohydrate metabolism in Euglena gracilis: Reverse genetics-based evaluation of genes coding for enzymes linked to paramylon accumulation

Euglena gracilis is a eukaryotic single-celled and photosynthetic organism grouped under the kingdom Protista. This phytoflagellate can accumulate the carbon photoassimilate as a linear β-1,3-glucan chain called paramylon. This storage polysaccharide can undergo degradation to provide glucose units to obtain ATP and reducing power both in aerobic and anaerobic growth conditions. Our group has recently characterized an essential enzyme for accumulating the polysaccharide, the UDP-glucose pyrophosphorylase (Biochimie vol 154, 2018, 176–186), which catalyzes the synthesis of UDP-glucose (the substrate for paramylon synthase). Additionally, the identification of nucleotide sequences coding for putative UDP-sugar pyrophosphorylases suggests the occurrence of an alternative source of UDP-glucose. In this study, we demonstrate the active involvement of both pyrophosphorylases in paramylon accumulation. Using techniques of single and combined knockdown of transcripts coding for these proteins, we evidenced a substantial decrease in the polysaccharide synthesis from 39 ± 7 μg/106 cells determined in the control at day 21st of growth. Thus, the paramylon accumulation in Euglena gracilis cells decreased by 60% and 30% after a single knockdown of the expression of genes coding for UDP-glucose pyrophosphorylase and UDP-sugar pyrophosphorylase, respectively. Besides, the combined knockdown of both genes resulted in a ca. 65% reduction in the level of the storage polysaccharide. Our findings indicate the existence of a physiological dependence between paramylon accumulation and the partitioning of sugar nucleotides into other metabolic routes, including the Leloir pathway's functionality in Euglena gracilis.Fil: Muchut, Robertino José. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Santa Fe. Instituto de Agrobiotecnología del Litoral. Universidad Nacional del Litoral. Instituto de Agrobiotecnología del Litoral; ArgentinaFil: Calloni, Rodrigo Daniel. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Santa Fe. Instituto de Agrobiotecnología del Litoral. Universidad Nacional del Litoral. Instituto de Agrobiotecnología del Litoral; ArgentinaFil: Arias, Diego Gustavo. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Santa Fe. Instituto de Agrobiotecnología del Litoral. Universidad Nacional del Litoral. Instituto de Agrobiotecnología del Litoral; ArgentinaFil: Arce, Agustín Lucas. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Santa Fe. Instituto de Agrobiotecnología del Litoral. Universidad Nacional del Litoral. Instituto de Agrobiotecnología del Litoral; ArgentinaFil: Iglesias, Alberto Alvaro. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Santa Fe. Instituto de Agrobiotecnología del Litoral. Universidad Nacional del Litoral. Instituto de Agrobiotecnología del Litoral; ArgentinaFil: Guerrero, Sergio Adrian. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Santa Fe. Instituto de Agrobiotecnología del Litoral. Universidad Nacional del Litoral. Instituto de Agrobiotecnología del Litoral; Argentin

Elucidating paramylon and other carbohydrate metabolism in Euglena gracilis: Kinetic characterization, structure and cellular localization of UDP-glucose pyrophosphorylase

Many oligo and polysaccharides (including paramylon) are critical in the Euglena gracilis life-cycle and they are synthesized by glycosyl transferases using UDP-glucose as a substrate. Herein, we report the molecular cloning of a gene putatively coding for a UDP-glucose pyrophosphorylase (EgrUDP-GlcPPase) in E. gracilis. After heterologous expression of the gene in Escherichia coli, the recombinant enzyme was characterized structural and functionally. Highly purified EgrUDP-GlcPPase exhibited a monomeric structure, able to catalyze synthesis of UDP-glucose with a Vmax of 3350 U.mg−1. Glucose-1P and UTP were the preferred substrates, although the enzyme also used (with lower catalytic efficiency) TTP, galactose-1P and mannose-1P. Oxidation by hydrogen peroxide inactivated the enzyme, an effect reversed by reduction with dithiothreitol or thioredoxin. The redox process would involve sulfenic acid formation, since no pair of the 7 cysteine residues is close enough in the 3D structure of the protein to form a disulfide bridge. Electrophoresis studies suggest that, after oxidation, the enzyme arranges in many enzymatically inactive structural conformations; which were also detected in vivo. Finally, confocal fluorescence microscopy provided evidence for a cytosolic (mainly in the flagellum) localization of the enzyme.Fil: Muchut, Robertino José. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Santa Fe. Instituto de Agrobiotecnología del Litoral. Universidad Nacional del Litoral. Instituto de Agrobiotecnología del Litoral; ArgentinaFil: Calloni, Rodrigo Daniel. Universidad Nacional del Litoral; ArgentinaFil: Herrera, Fernando Enrique. Universidad Nacional del Litoral; ArgentinaFil: Garay, Alberto Sergio. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Santa Fe. Instituto de Agrobiotecnología del Litoral. Universidad Nacional del Litoral. Instituto de Agrobiotecnología del Litoral; ArgentinaFil: Arias, Diego Gustavo. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Santa Fe. Instituto de Agrobiotecnología del Litoral. Universidad Nacional del Litoral. Instituto de Agrobiotecnología del Litoral; ArgentinaFil: Iglesias, Alberto Daniel. Universidad Nacional del Litoral; ArgentinaFil: Guerrero, Sergio Adrian. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Santa Fe. Instituto de Agrobiotecnología del Litoral. Universidad Nacional del Litoral. Instituto de Agrobiotecnología del Litoral; Argentin