Implication of the NLRP3 inflammasome in the unconventional secretion of the FADD protein

FADD (FAS-Associated Death Domain) est la protéine adaptatrice clé de l'apoptose via les récepteurs de mort. Elle est également impliquée dans d'autres types de mort cellulaire, mais aussi dans des mécanismes de survie, la prolifération et le cycle cellulaire. C'est donc une protéine régulatrice de la vie et de la mort et un changement de son expression peut avoir de graves conséquences physiopathologiques. Par exemple, l'équipe a montré que l'expression de la protéine FADD pouvait être perdue dans des biopsies de cancer du poumon et que cette perte était corrélée à la sécrétion de la protéine FADD dans le milieu extracellulaire. Cette sécrétion étant associée à l'agressivité et au développement tumoral, il apparaît important de comprendre quels sont les mécanismes moléculaires impliqués dans ce processus. En plus de son rôle dans la cancérogenèse, FADD est aussi impliquée dans l'immunité innée et l'inflammation. En effet, FADD participe à l'activation de l'inflammasome NLRP3 via les trois voies décrites : canonique, non canonique et alternative. L'inflammasome NLRP3 est un gros complexe multiprotéique composé de la protéine senseur NLRP3, de la protéine adaptatrice ASC et de la pro-caspase-1, qui s'assemble en réponse à des signaux de stress ou de danger. Il conduit à l'activation de réponses inflammatoires médiées par la caspase-1, telles que le clivage et la sécrétion non conventionnelle de la cytokine pro-inflammatoire interleukine-1 beta (IL-1b). L'inflammasome NLRP3 a été largement impliqué dans le développement et la progression de plusieurs rhumatismes inflammatoires chroniques comme la goutte et, plus récemment, la polyarthrite rhumatoïde (PR). Des protéines participant au complexe NRLP3 telles que ASC et la caspase-1 peuvent être co-sécrétées avec l'IL-1b, sous la régulation de l'inflammasome NLRP3. Puisque FADD participe à son activation, les objectifs de ma thèse étaient d'étudier l'implication de l'inflammasome NLRP3 dans la sécrétion de FADD ; puis de caractériser la ou les voie(s) de sécrétion de la protéine FADD ; et enfin de déterminer si cette sécrétion pouvait être retrouvée in vivo dans des pathologies rhumatismales. Pour cette étude, nous avons utilisé la lignée monocytaire humaine THP-1, modèle classique d'étude de l'inflammasome NLRP3. Nous avons montré que la protéine FADD est sécrétée suite à la stimulation de l'inflammasome NLPR3 par des activateurs des voies canonique (nigéricine, ATP, cristaux) et non canonique (Escherichia coli entéropathogène) mais pas alternative (lipopolysaccharide). Cette sécrétion de FADD requière un efflux de potassium. A l'aide de la technique CRISPR/Cas9, nous avons montré que la sécrétion nécessite également les protéines NLRP3, ASC et caspase-1. De plus, nous avons identifié la protéine FADD comme une protéine sécrétée de façon non conventionnelle dans des microvésicules dérivées de la membrane plasmique, mais pas dans des exosomes. Ces vésicules contiennent également les protéines IL-1b, NLRP3, ASC et caspase-1. Ces résultats ont été replacés dans un contexte physiopathologique puisque des monocytes sanguins de donneurs sains sécrètent également FADD suite à l'activation canonique de l'inflammasome NLRP3. La sécrétion par des monocytes de patients atteints de PR est augmentée et de fortes concentrations de protéine FADD sont détectées dans le sérum de patients atteints de PR (cohorte ESPOIR) mais pas de donneurs sains. Dans cette cohorte, la concentration de FADD sérique est corrélée à l'évolution de l'érosion osseuse articulaire des patients. De plus, de fortes concentrations de protéine FADD sont également détectées localement dans le liquide articulaire de patients atteints de PR et de goutte, mais pas d'arthrose (pathologie peu inflammatoire). Ces concentrations sont positivement corrélées à l'état inflammatoire de l'articulation. Ainsi, la protéine FADD sécrétée serait un nouveau marqueur de l'inflammation dans ces pathologies rhumatismales.FADD (FAS-Associated Death Domain) is a key adaptor protein of death receptor-mediated apoptosis. FADD is also implicated in other types of cell death, but also in survival mechanisms, proliferation and cell cycle progression. Therefore, FADD is a regulator of life and death and a change of its expression can have dramatic physiopathological consequences. For instance, the team has showed that FADD protein expression can be lost in lung cancer biopsies. This loss is correlated with FADD protein secretion in the extracellular compartment. Since this secretion is associated with tumor development and aggressiveness, it is important to decipher the molecular mechanisms behind this process. Besides its role in tumorigenesis, FADD is also involved in innate immunity and inflammation. Indeed, FADD participates to the canonical, non-canonical and alternative pathways of activation of the NLRP3 inflammasome. This inflammasome is a large multiprotein complex composed of the sensor protein NLRP3, the adaptor protein ASC and the pro-caspase-1. This complex assembles in response to stress or danger signals. This leads to the activation of inflammatory responses mediated by caspase-1, such as cleavage and unconventional secretion of the pro-inflammatory cytokine interleukin-1 beta (IL-1b). The NLRP3 inflammasome is largely implicated in the development and progression of several chronic inflammatory rheumatisms like gout and, more recently, rheumatoid arthritis (RA). Proteins of the NLRP3 complex such as ASC and caspase-1 can be co-secreted with IL-1b following the NRLP3 inflammasome activation. Since FADD participates to the complex, the aims of my thesis were to study the involvement of the NLRP3 inflammasome in the FADD secretion process; to characterize the secretion pathway(s) implicated; and to determine if this secretion can occur in vivo during the course of chronic inflammatory rheumatisms. For this study, we used the THP-1 human monocytic cell line that is an established model for inflammasome studies. We showed that FADD protein is secreted following cell stimulation with activators of the canonical (nigericin, ATP, crystals) and non-canonical (enteropathogenic Escherichia coli) but not alternative (lipopolysaccharide) NLRP3 inflammasome pathways. Furthermore, this FADD secretion process requires potassium efflux. Using CRIPSR/Cas9 technology, we showed that FADD secretion also requires NLRP3, ASC and caspase-1 proteins. Moreover, we have identified FADD as a new member of the unconventionally secreted protein family. Indeed, FADD is secreted in plasma membrane-derived microvesicles but not in exosomes. These microvesicles also contain IL-1b, NLRP3, ASC and caspase-1 proteins. In a more physiopathological context, we showed that blood-derived primary monocytes from healthy donors secrete FADD following canonical NLRP3 inflammasome activation, and this secretion is enhanced using monocytes from RA-suffering patients. In addition, high concentration of FADD protein is detected in the sera from RA patients (ESPOIR cohort) as compared to sera from healthy donors. In this cohort, sera concentration of FADD is correlated with patient's joint bone erosion progression. Moreover, high concentration of FADD is also detected locally in the synovial fluid from RA-, gout- but not osteoarthritis (a poorly inflammatory disease)-suffering patients. This concentration is positively correlated with the inflammatory status of the joint. Thus, secreted FADD protein can be a new marker of joint inflammation in these pathologies

FADD at the Crossroads between Cancer and Inflammation

International audienceInitially described as an adaptor molecule for death receptor (DR)-mediated apoptosis, Fas-associated death domain (FADD) was later implicated in nonapoptotic cellular processes. During the last decade, FADD has been shown to participate and regulate most of the signalosome complexes, including necrosome, FADDosome, innateosome, and inflammasome. Given the role of these signaling complexes, FADD has emerged as a new actor in innate immunity, inflammation, and cancer development. Concomitant to these new roles, a surprising number of mechanisms deemed to regulate FADD functions have been identified, including post-translational modifications of FADD protein and FADD secretion. This review focuses on recent knowledge of the biological roles of FADD, a pleiotropic molecule having multiple partners, and its impact in cancer, innate immunity, and inflammation

Innenrücktitelbild: Small Molecule Inhibitors of Interferon‐Induced JAK‐STAT Signalling (Angew. Chem. 32/2022)

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Inactivation of cytidine triphosphate synthase 1 prevents fatal auto-immunity in mice

Abstract De novo synthesis of the pyrimidine, cytidine triphosphate (CTP), is crucial for DNA/RNA metabolism and depends on the CTP synthetases, CTPS1 and −2. Partial CTPS1 deficiency in humans has previously been shown to lead to immunodeficiency, with impaired expansion of T and B cells. Here, we examine the effects of conditional and inducible inactivation of Ctps1 and/or Ctps2 on mouse embryonic development and immunity. We report that deletion of Ctps1, but not Ctps2, is embryonic-lethal. Tissue and cells with high proliferation and renewal rates, such as intestinal epithelium, erythroid and thymic lineages, activated B and T lymphocytes, and memory T cells strongly rely on CTPS1 for their maintenance and growth. However, both CTPS1 and CTPS2 are required for T cell proliferation following TCR stimulation. Deletion of Ctps1 in T cells or treatment with a CTPS1 inhibitor rescued Foxp3-deficient mice from fatal systemic autoimmunity and reduced the severity of experimental autoimmune encephalomyelitis. These findings support that CTPS1 may represent a target for immune suppression