HP1 Recruits Activity-Dependent Neuroprotective Protein to H3K9me3 Marked Pericentromeric Heterochromatin for Silencing of Major Satellite Repeats

H3 lysine 9 trimethylation (H3K9me3) is a histone posttranslational modification (PTM) that has emerged as hallmark of pericentromeric heterochromatin. This constitutive chromatin domain is composed of repetitive DNA elements, whose transcription is differentially regulated. Mammalian cells contain three HP1 proteins, HP1α, HP1β and HP1γ These have been shown to bind to H3K9me3 and are thought to mediate the effects of this histone PTM. However, the mechanisms of HP1 chromatin regulation and the exact functional role at pericentromeric heterochromatin are still unclear. Here, we identify activity-dependent neuroprotective protein (ADNP) as an H3K9me3 associated factor. We show that ADNP does not bind H3K9me3 directly, but that interaction is mediated by all three HP1 isoforms in vitro. However, in cells ADNP localization to areas of pericentromeric heterochromatin is only dependent on HP1α and HP1β. Besides a PGVLL sequence patch we uncovered an ARKS motif within the ADNP homeodomain involved in HP1 dependent H3K9me3 association and localization to pericentromeric heterochromatin. While knockdown of ADNP had no effect on HP1 distribution and heterochromatic histone and DNA modifications, we found ADNP silencing major satellite repeats. Our results identify a novel factor in the translation of H3K9me3 at pericentromeric heterochromatin that regulates transcription

Identifizierung und Charakterisierung von ADNP als neuer Faktor im Heterochromatin

In eukaryotischen Zellen ist die genetische Information in Form von langen, linearen DNA Molekülen im Zellkern gespeichert. Zeit- und Gewebespezifische Genexpressionsmuster werden durch die Kombination von DNA mit Proteinen manifestiert, was zu einer Struktur namens Chromatin führt. Das grundlegende, sich wiederholende Element des Chromatins ist das Nukleosom. In diesem ist die DNA um ein Oktamer von Histon-Proteinen gewunden. Die Nukleosomen wiederum sind durch Teile von Linker-DNA verbunden. DNA und Histone unterliegen chemischen Modifikationen, die mit bestimmten Chromatin-Zuständen assoziiert sind. Einige Faktoren, die diese Modifikationen erzeugen bzw. erkennen sind in den vergangenen Jahren beschrieben worden. Heterochromatin ist eine Chromatin Form, die durch Kompaktierung, transkriptionelle Inaktivität und späte Replikation in der S-Phase gekennzeichnet ist. Es ist mit Methylierung von DNA und Histonen assoziiert. Ein Kennzeichen von Heterochromatin ist die Trimethylierung von Histon H3 Lysin 9 (H3K9me3). Sie wird durch die Methyltransferase Suv39 erzeugt und von Heterochromatin Protein 1 (HP1) erkannt. HP1 existiert in Säugerzellen in drei Isoformen. Wie diese und andere Enzyme und Faktoren spezielle Chromatin-Zustände erzeugen und aufrechterhalten, ist noch nicht vollständig geklärt. Für ein besseres Verständnis von Heterochromatin-Faktoren, habe ich mit Hilfe von stabiler Isotopenmarkierung von Aminosäuren in Zellkultur (SILAC) in einem H3K9me3 Pull-down-Experiment neue Interaktionspartner identifiziert. Activity dependant Neuroprotector (ADNP) war einer der Faktoren, die zuvor noch nicht im Kontext von Heterochromatin beschrieben wurden. Die Assoziation von ADNP mit H3K9me3 wurde in unabhängigen Experimenten bestätigt und der Faktor wurde näher charakterisiert. Zellbasierte und in vitro-Assays zeigten, dass ADNP nicht direkt an H3K9me3 bindet, sondern durch HP1 zu dieser Modifikation rekrutiert wird. Diese Assoziation von ADNP mit H3K9me3 konnte von allen drei Isoformen von HP1 vermittelt werden. Die Kartierung der Interaktions-Schnittstelle ergab, dass eine Bindung der HP1 chromoshadow Domäne an ein PxVxL Motiv innerhalb der ADNP Homöodomäne wesentlich an der Rekrutierung beteiligt ist. Die Mutation des PxVxL Motivs verursachte eine teilweise Delokalisierung vom Heterochromatin. Eine weitere Mutation eines ARKS Motivs, welches ebenfalls in der ADNP Homöodomäne vorhanden ist, verstärkte diesen Effekt. Es konnte jedoch nicht nachgewiesen werden, dass eine mögliche Lysinmethylierung in diesem Motiv an der HP1 Bindung beteiligt ist. Zur Untersuchung der Funktion von ADNP nutzte ich Knock-down in Zellen durch siRNA. Ich analysierte, ob ADNP typische Merkmale von Heterochromatin, wie die Verteilung von Histon-Modifikationen, die Lokalisierung von HP1 sowie die DNA-Methylierung, bestimmt. Ein Einfluss von ADNP auf diese Eigenschaften konnte jedoch nicht nachgewiesen werden. In Luciferase-Reporter-Assays zeigte ADNP transkriptionelles Silencing Potenzial. Knock-down und Überexpressions-Experimente ergaben, dass ADNP spezifisch am Silencing von Major Satellite Repeats im perizentromerischen Heterochromatin beteiligt ist. Um herauszufinden, über welchen Mechanismus ADNP diese transkriptionelle Repression ausübt, sind weitere Studien erforderlich. Zusammenfassend identifizierte ich in dieser Arbeit ADNP als eine neue Komponente von perizentromerischem Heterochromatin, die von HP1 rekrutiert wird und an der Repression der Major Satellite Repeats beteiligt ist. Diese Studie hat zu einem tieferen Verständnis des Zusammenspiels von Suv39/H3K9me3/HP1 und dessen Auswirkungen auf die Chromatin-Funktion beigetragen

Src-dependent repression of ARF6 is required to maintain podosome-rich sealing zones in bone-digesting osteoclasts

Bone digestion occurs when osteoclasts adhere onto bone surfaces and polarize to form acidic, hydrolase-rich resorption lacunae. For this process, they condense their actin-rich podosomes in tight belts to establish sealing zones, which segregate their basal membranes from those facing resorption lacunae. This polarization process remains poorly understood. Here, we combined quantitative proteomics and gene silencing to identify new substrates of the Src tyrosine kinase, a key regulator of osteoclast function. We now report that a depletion of the ARF GTPase-activating protein GIT2, which localizes to sealing zones upon Src phosphorylation, or a lack of GTP hydrolysis on ARF6 impairs sealing zone formation and polarized membrane traffic. Surprisingly, the Rho guanine nucleotide exchange factors α and β PIX, which usually coordinate ARF and Rho signaling, were found to be dispensable. We conclude that the Src-dependent localization of GIT2 is essential for down-regulating ARF6 activity at sealing zones, and thus for maintaining osteoclast polarity

Chromatin Affinity Purification and Quantitative Mass Spectrometry Defining the Interactome of Histone Modification Patterns*

DNA and histone modifications direct the functional state of chromatin and thereby the readout of the genome. Candidate approaches and histone peptide affinity purification experiments have identified several proteins that bind to chromatin marks. However, the complement of factors that is recruited by individual and combinations of DNA and histone modifications has not yet been defined. Here, we present a strategy based on recombinant, uniformly modified chromatin templates used in affinity purification experiments in conjunction with SILAC-based quantitative mass spectrometry for this purpose. On the prototypic H3K4me3 and H3K9me3 histone modification marks we compare our method with a histone N-terminal peptide affinity purification approach. Our analysis shows that only some factors associate with both, chromatin and peptide matrices but that a surprisingly large number of proteins differ in their association with these templates. Global analysis of the proteins identified implies specific domains mediating recruitment to the chromatin marks. Our proof-of-principle studies show that chromatin templates with defined modification patterns can be used to decipher how the histone code is read and translated

Effect of [F-18]FMISO stratified dose-escalation on local control in FaDu hSCC in nude mice

Objective: To investigate the effect of radiation dose-escalation on local control in hypoxic versus non-hypoxic hypoxic tumours defined using [F-18]fluoromisonidazole ([F-18]FMISO) PET. Materials and methods: FaDu human squamous cell carcinomas (hSCCs) growing subcutaneously in nude mice were subjected to [F-18]FMISO PET before irradiation with single doses of 25 or 35 Gy under normal blood flow conditions. [F-18]FMISO hypoxic volume (HV) and maximum standardised uptake value (SUVmax) were used to quantify tracer uptake. The animals were followed up for at least 120 days after irradiation. The endpoints were permanent local tumour control and time to local recurrence. Results: HV varied between 38 and 291 mm(3) (median 105 mm(3)). Non-hypoxic tumours (HV below median) showed significantly better local control after single dose irradiation than hypoxic tumours (HV above median) (p = 0.046). The effect of dose was significant and not different in non-hypoxic and in hypoxic tumours (HR= 0.82 [95% Cl 0.71; 0.93], p = 0.002 and HR= 0.86 [0.78; 0.95], p = 0.001, respectively). Dose escalation resulted in an incremental increase of local tumour control from low-dose hypoxic, over low-dose non-hypoxic and high-dose hypoxic to high-dose non-hypoxic tumours. SUVmax did not reveal significant association with local control at any dose level. Conclusions: The negative effect of [F-18]FMISO HV on permanent local tumour control supports the prognostic value of the pre-treatment [F-18]FMISO HV. Making the assumption that variable [F-18]FMISO uptake in different FaDu tumours which all have the same genetic background may serve as an experimental model of intratumoural heterogeneity, the data support the concept of dose-escalation with inhomogeneous dose distribution based on pre-treatment [F-18]FMISO uptake. This result needs to be confirmed in other tumour models and using fractionated radiotherapy schedules