Clonagem e expressão heteróloga de uma nova isoforma de metaloprotease do tipo astacina presente no veneno de aranha-marrom (Loxosceles intermedia)

Orientadora : Profª. Drª. Olga Meiri ChaimCo-orientador : Prof. Dr. Silvio Sanches VeigaDissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular. Defesa: Curitiba, 26/02/2013Bibliografia : fls 136-156Resumo: O veneno das aranhas do gênero Loxosceles é composto por várias classes de moléculas biologicamente ativas com ação tóxica e/ou enzimática. Dentre estas toxinas, destacam-se serinoproteases, fosfolipases, hialuronidases e metaloproteases do tipo astacinas. As astacinas são enzimas secretadas e estão relacionadas a eventos envolvendo homeostase; ovulação e fertilização; embriogênese, como na morfogênese de tecidos; proliferação e migração celular; progressão do ciclo celular e apoptose; entre outros. Durante o envenenamento, o papel das metaloproteases no local da picada deve estar relacionado com a degradação de componentes da Matriz Extracelular, sendo então consideradas possíveis fatores de espalhamento. Por meio de estudos envolvendo biologia molecular foi possível caracterizar três isoformas de proteínas to tipo astacinas no veneno de Loxosceles intermedia, determinadas LALP1, LALP2 e LALP3. Destas, apenas a LALP1 clonada e obtida através de expressão heteróloga. Foi demonstrado que a LALP1 possui atividade sobre moléculas de matriz extracelular, como gelatina, fibrinogênio e fibronectina. Ainda, dados recentes demonstraram que as proteases do tipo astacinas constituem uma família de genes em aranhas do gênero Loxosceles e que novas isoformas podem ser encontradas. Por conseguinte, o objetivo deste trabalho foi efetuar a clonagem e expressão heteróloga de uma nova isoforma de metaloprotease presente no veneno de L. intermedia por meio de técnicas de biologia molecular, visando ainda possibilidades futuras de estudos estruturais e funcionais desta enzima. A predição da estrutura tridimensional da LALP3 revelou que a proteína possui aspectos estruturais característicos das astacinas, os quais são relevantes para a atividade destas enzimas. Os resultados obtidos da clonagem e expressão da LALP3 em vetor pET20b+ mostraram que a utilização de diferentes condições de temperatura, concentração de indutor e meio de cultura não permitiram a obtenção da proteína recombinante na condição solúvel. Desta forma, foi realizada a clonagem e expressão da LALP3 em vetor pET-SUMO, o qual permite a adição da etiqueta de solubilidade SUMO à proteína de interesse. Dentre as condições avaliadas foi verificado que as expressões utilizando as cepas de E. coli SHuffle T7 Express LysY e BL21 STAR (DE3) One Shot resultaram na proteína recombinante na condição solúvel. Após a purificação da LALP3 obtida na cepa SHuffle T7 Express LysY foram realizados testes de atividade, os quais mostraram que a LALP3 obtida não apresentou atividade sobre moléculas de fibrinogênio, azocaseína e colágeno tipo I desnaturado (gelatina). Como conclusão tem-se que os passos de purificação devem ser refinados para livrar a amostra de contaminantes e que outras estratégias podem ser utilizadas, como técnicas de refolding mais elaboradas e o emprego de sistemas de expressão utilizando organismos eucarióticos.Abstract: The venom from spiders of Loxosceles genus composed of several classes of biologically active molecules with toxic or enzymatic action. Among these toxins serinoproteases, phopholipases, hyaluronidases and astacin-like metalloproteases stand out. Astacins are secreted enzymes and are associated to events involving homeostasis; ovulation and fertilization; embryogenesis, as in tissue morphogenesis; cell migration and proliferation; cell cycle progression and apoptosis; among others. During envenomation, the role of the metalloproteases on the bite site is probably related to Extracelular Matrix degradation, being considered possible spreading factors. Through molecular biology studies it was possible to characterize three isoforms of astacin-like metalloproteases from Loxosceles intermedia, named LALP1, LALP2 and LALP3. From these, only LALP1 was cloned and obtained through heterologous expression. It was demonstrated that LALP1 is able to degrade extracellular matrix components, such gelatin, fibrinogen and fibronectin. Also, recent data showed that astacin-like proteases constitute a family of genes in spiders of Loxosceles genus and new isoforms are likely to be found. Therefore, the objective of this work was to carry out the cloning and heterologous expression of a new isoform of metalloprotease present in L. intermedia venom though molecular biology techniques, aiming for future possibilities of structural and functional studies of this protein. The three dimensional structure prediction of LALP3 revealed that the protein has structural aspects characteristic of astacins, which are important for the activity of such enzymes. The results obtained from the cloning and expression of LALP3 in pET20b+ vector depicted that different conditions of temperature, inductor concentration and culture medium did not yield the soluble protein. Therefore, the cloning and expression of LALP3 in pET-SUMO vector, which allows de addition of the solubility tag SUMO, were carried out. Among the conditions evaluated it was verified that the expressions using the E. coli strains SHuffle T7 Express LysY and BL21 STAR (DE3) One Shot yielded the soluble protein. After the purification of LALP3 obtained using the strain SHuffle T7 Express LysY activity tests were performed, which showed that LALP3 was not able to hydrolyze fibrinogen, azocasein and type I denatured collagen (gelatin) molecules. In conclusion it is stated that purification steps must be refined in order to free the sample from contaminants and other strategies can be used, as elaborated refolding techniques and the employment of expression systems using eukaryotic organisms

Citotoxicidade e inflamação : a atividade da toxina dermonecrótica do veneno de aranha-marrom sobre membranas de células endoteliais in vitro

Orientadora : Profª Drª Olga Meiri ChaimCoorientador : Prof. Dr. Silvio Sanches VeigaTese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular. Defesa: Curitiba, 01/02/2017Inclui referências : f. 110-130Resumo: As fosfolipases de aranhas do gênero Loxosceles, também conhecidas como toxinas dermonecróticas, são as toxinas do veneno melhor caracterizadas do ponto de vista bioquímica e biológica e estão relacionadas a diversos eventos, como hemólise, coagulação intravascular disseminada, edema e indução de resposta inflamatória. Os principais substratos lipídicos para estas toxinas são a esfingomielina e lisofosfatidilcolina que, após sua hidrólise, geram como produtos a ceramida-1-fosfato e o ácido lisofosfatídico, respectivamente, lipídeos bioativos que estão envolvidos em diversos processos celulares, incluindo a modulação da resposta inflamatória. A toxina LiRecDT1, a primeira isoforma de fosfolipase recombinante de L. intermedia caracterizada, além de promover o recrutamento de neutrófilos em pele de coelho, se liga à membrana de células endoteliais de aorta de coelho, promovem alterações morfológicas e induzem a reorganização de microdomínios de membrana caracterizados por lipid rafts, porém, os mecanismos envolvidos neste processo ainda permanecem desconhecidos. Desta forma, os objetivos deste trabalho compreenderam a análise dos mecanismos moleculares da ação do veneno e da LiRecDT1 após a interação com a membrana de células endoteliais, visando determinar as alterações morfológicas das células, alterações bioquímicas da membrana plasmática, e a possível internalização da toxina recombinante. Primeiramente, as toxinas LiRecDT1 e LiRecDT1/H12A (isoforma mutada com atividade residual) foram expressas em cepa de E. coli e então avaliadas em relação à sua atividade esfingomielinásica, de modo que as toxinas foram obtidas com alto grau de pureza e tanto o veneno como a LiRecDT1 apresentaram atividade esfingomielinásica, sendo que a LiRecDT1/H12A apresentou atividade residual. Em seguida, foi verificado que o veneno promove a desadesão de células endoteliais de aorta de coelho (RAEC) e que a LiRecDT1 promove a vacuolização citoplasmática e alteração na morfologia celular após 2 horas de incubação com a toxina, sendo que este evento é observado até 24 horas. Ainda, a interação da LiRecDT1 com a membrana plasmática destas células foi avaliada por microscopia de fluorescência confocal, TIRF, e de super-resolução, onde foi possível visualizar que a LiRecDT1 se liga à membrana das células e promove a reorganização de lipid rafts após 1 hora, e se liga à caveolina-1 presente nestes domínios de maneira tempo-dependente. Ainda, os dados da microscopia de super-resolução sugeriram a possível endocitose da LiRecDT1, o que foi comprovado pela co-localização com proteínas do sistema endossomo/lisossomo após 1 e 4 horas, por microscopia confocal. Sendo assim, fica evidente que a toxina interage com a membrana plasmática de células endoteliais, especificamente com microdomínios de lipid rafts, e é internalizada e endereçada para compartimentos do sistema endossomo/lisossomo. Contudo, novos estudos devem ser realizados a fim de caracterizar possíveis parceiros moleculares para a LiRecDT1, assim como investigar vias de sinalização ativadas/inativadas decorrentes da reorganização dos microdomínios de membrana. Além disso, é discutida a possibilidade de a LiRecDT1 estar sendo enviada para a membrana ou até mesmo ser exocitada após a sua internalização, de modo que outros destinos intracelulares para a toxina recombinante podem ser exploradas. Palavras-chace: Fosfolipases-D, L. intermedia, lipid rafts, endocitoseAbstract: Phospholipases from Loxosceles spiders, also known as dermonecrotic toxins, are the best-characterized toxins in the venom regarding their biochemical and biological activities, and they are related to several events such as hemolysis, disseminated intravascular coagulation, edema, and induction of inflammatory responses. Their main lipid substrates are sphingomyelin and lysophosphatidylcholine, that, agter hydrolysis, generate ceramide-1-phosphate and lysophosphatidic acid as subproducts, respectively, which are bioactive lipids involved in cellular processes including the modulation of inflammatory responses. The toxin LiRecDT1, the first characterized recombinant phospholipase isoform from L. intermedia, besides recruiting neutrophils in rabbit skin, binds rabbit aorta endothelial cells membrane, and induce lipid raft reorganization, however, the mechanisms that drive such process remain unknown. Thus, the objectives os this work regarded the analysis of the molecular mechanisms of action of the venom and LiRecDT1 after interaction with endothelial cell membrane, aiming to determine the cell morphological alterations, plasma membrane biochemical alterations, and the possible internalization of the recombinant toxin. First, the toxins LiRecDT1 and LiRecDT1/H12A (mutated isoform with residual activity) were expressed in an E. coli strain and then evaluated in relation to their sphingomyelinase activity. The toxins were obtained with high putiry levels and the venom and LiRecDT1 showed sphingomyelinase activity, and LiRecDT1/H12A showed only residual activity. After, it was shown that the venom promotes rabbit aorta endothelial cell (RAEC) detachment, and that LiRecDT1 induces cell vacuolization and cell morphology alteration after two hours incubation with the toxin, event still observed after 24 hours. Moreover, the interaction of LiRecDT1 with the plasma membrane of these cells was evaluated by confocal fluorescence microscopy, TIRF, and superresolution microscopy, where it was observed that LiRecDT1 binds the cell membrane and promote lipid raft reorganization after 1 hour, and binds caveolin- 1 present in these domains in a time-dependent manner. Data from the superresolution microscopy suggested the possible LiRecDT1 endocytosis, which was proved to be true after the co-localization with proteins present in endosome/lysosome compartments after 1 and 4 hours, by confocal microscopy. Thus, its evident that the toxin interacts with endothelial cell plasma membrane , especifically with lipid rafts, and is internalized and sent to endosomal/lysosomal compartments. However, more studies must be taken in order to characterize possible molecular partners for LiRecDT1, as well as investigate signaling pathways modulated by the reorganization of lipid rafts. Besides, the possibility of LiRecDT1 being sent to the membrane or even being exocytosed after its internalization is discussed, as other intracellular targets for the recombinant toxin may be explored. Key words: Phospholipases-D, L. intermedia, lipid rafts, endocytosis

Clonagem e expressão heteróloga de uma nova isoforma de metaloprotease do tipo astacina presente no veneno de aranha-marrom (Loxosceles intermedia)

Orientadora : Profª. Drª. Olga Meiri ChaimCo-orientador : Prof. Dr. Silvio Sanches VeigaDissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular. Defesa: Curitiba, 26/02/2013Bibliografia : fls 136-156Resumo: O veneno das aranhas do gênero Loxosceles é composto por várias classes de moléculas biologicamente ativas com ação tóxica e/ou enzimática. Dentre estas toxinas, destacam-se serinoproteases, fosfolipases, hialuronidases e metaloproteases do tipo astacinas. As astacinas são enzimas secretadas e estão relacionadas a eventos envolvendo homeostase; ovulação e fertilização; embriogênese, como na morfogênese de tecidos; proliferação e migração celular; progressão do ciclo celular e apoptose; entre outros. Durante o envenenamento, o papel das metaloproteases no local da picada deve estar relacionado com a degradação de componentes da Matriz Extracelular, sendo então consideradas possíveis fatores de espalhamento. Por meio de estudos envolvendo biologia molecular foi possível caracterizar três isoformas de proteínas to tipo astacinas no veneno de Loxosceles intermedia, determinadas LALP1, LALP2 e LALP3. Destas, apenas a LALP1 clonada e obtida através de expressão heteróloga. Foi demonstrado que a LALP1 possui atividade sobre moléculas de matriz extracelular, como gelatina, fibrinogênio e fibronectina. Ainda, dados recentes demonstraram que as proteases do tipo astacinas constituem uma família de genes em aranhas do gênero Loxosceles e que novas isoformas podem ser encontradas. Por conseguinte, o objetivo deste trabalho foi efetuar a clonagem e expressão heteróloga de uma nova isoforma de metaloprotease presente no veneno de L. intermedia por meio de técnicas de biologia molecular, visando ainda possibilidades futuras de estudos estruturais e funcionais desta enzima. A predição da estrutura tridimensional da LALP3 revelou que a proteína possui aspectos estruturais característicos das astacinas, os quais são relevantes para a atividade destas enzimas. Os resultados obtidos da clonagem e expressão da LALP3 em vetor pET20b+ mostraram que a utilização de diferentes condições de temperatura, concentração de indutor e meio de cultura não permitiram a obtenção da proteína recombinante na condição solúvel. Desta forma, foi realizada a clonagem e expressão da LALP3 em vetor pET-SUMO, o qual permite a adição da etiqueta de solubilidade SUMO à proteína de interesse. Dentre as condições avaliadas foi verificado que as expressões utilizando as cepas de E. coli SHuffle T7 Express LysY e BL21 STAR (DE3) One Shot resultaram na proteína recombinante na condição solúvel. Após a purificação da LALP3 obtida na cepa SHuffle T7 Express LysY foram realizados testes de atividade, os quais mostraram que a LALP3 obtida não apresentou atividade sobre moléculas de fibrinogênio, azocaseína e colágeno tipo I desnaturado (gelatina). Como conclusão tem-se que os passos de purificação devem ser refinados para livrar a amostra de contaminantes e que outras estratégias podem ser utilizadas, como técnicas de refolding mais elaboradas e o emprego de sistemas de expressão utilizando organismos eucarióticos.Abstract: The venom from spiders of Loxosceles genus composed of several classes of biologically active molecules with toxic or enzymatic action. Among these toxins serinoproteases, phopholipases, hyaluronidases and astacin-like metalloproteases stand out. Astacins are secreted enzymes and are associated to events involving homeostasis; ovulation and fertilization; embryogenesis, as in tissue morphogenesis; cell migration and proliferation; cell cycle progression and apoptosis; among others. During envenomation, the role of the metalloproteases on the bite site is probably related to Extracelular Matrix degradation, being considered possible spreading factors. Through molecular biology studies it was possible to characterize three isoforms of astacin-like metalloproteases from Loxosceles intermedia, named LALP1, LALP2 and LALP3. From these, only LALP1 was cloned and obtained through heterologous expression. It was demonstrated that LALP1 is able to degrade extracellular matrix components, such gelatin, fibrinogen and fibronectin. Also, recent data showed that astacin-like proteases constitute a family of genes in spiders of Loxosceles genus and new isoforms are likely to be found. Therefore, the objective of this work was to carry out the cloning and heterologous expression of a new isoform of metalloprotease present in L. intermedia venom though molecular biology techniques, aiming for future possibilities of structural and functional studies of this protein. The three dimensional structure prediction of LALP3 revealed that the protein has structural aspects characteristic of astacins, which are important for the activity of such enzymes. The results obtained from the cloning and expression of LALP3 in pET20b+ vector depicted that different conditions of temperature, inductor concentration and culture medium did not yield the soluble protein. Therefore, the cloning and expression of LALP3 in pET-SUMO vector, which allows de addition of the solubility tag SUMO, were carried out. Among the conditions evaluated it was verified that the expressions using the E. coli strains SHuffle T7 Express LysY and BL21 STAR (DE3) One Shot yielded the soluble protein. After the purification of LALP3 obtained using the strain SHuffle T7 Express LysY activity tests were performed, which showed that LALP3 was not able to hydrolyze fibrinogen, azocasein and type I denatured collagen (gelatin) molecules. In conclusion it is stated that purification steps must be refined in order to free the sample from contaminants and other strategies can be used, as elaborated refolding techniques and the employment of expression systems using eukaryotic organisms