Maduración y fecundación de ovocitos bovinos in vitro : participación de las especies reactivas del oxígeno

The role of reactive oxygen species (ROS) in the processes related with gametes and embryo in vitro culture and manipulation is still controversial. It has been proposed that an adecquate level of O2 - (superoxide anion) would be necessary during bovine oocyte in vitro maturation (IVM) in order to increase their developmental competence. In coincidence, a gradual increase in ROS levels has been observed in embryos developing\nfrom 2-cells until morula stage, which could depend on the metabolic changes that occur in the bovine embryo. On the other hand, certain studies have demonstrated the expression of genes which codify for antioxidant enzymes throughout the in vitro culture of cumulusoocyte\ncomplexes. These studies propose that the storage of antioxidants in the oocyte\nduring its growth and maturation (in the forms of mRNA or proteins) would be important for the future embryo to achieve developmental competence.\nThe apparent contradiction in some of the existing reports, together with the results obtained in previous studies in our laboratory, suggest the need to develop further research to determine if ROS play an important role in the meiotic progress and\ncytoplasmic maturation of the oocyte. Therefore, the main aim of this work was to\ndetermine the possible fluctuation in ROS production during in vitro maturation and\nactivation of bovine oocytes and its relation with key events of both processes.\nIn this study, ROS production proved to be fluctuating during the whole process of IVM. A significant difference was observed in ROS generation between 2 and 18h, which could correspond to a period of time which demands a high energy production in the\nrespiratory chain for protein synthesis during the preparatory stages of IVM key events. With respect to oocyte activation, we observed distinct metabolic patterns between non-activated, sperm mediated and parthenogenetically activated oocytes. The different behaviour as regards ROS levels and oxidative activity in sperm mediated and parthenogenetic activation could be related to the difference in the Ca+2 waves which has been documented between both types of activation. The unique Ca+2 wave triggered by parthenogenetic activation would not be efficient to stimulate mitochondria consistently,\nbeing therefore responsible for the lower developmental competence reported in this type of activation. Modulating reduced gluthatione (GSH) levels we observed that although GSH role as antioxidant could be compensated by other components of the oocyte´s antioxidant system, its participation in the maintenance of the meiotic spindle morphology would be essential for maturation.\nWhen we analysed the effect of the modulation of nitric oxide (NO) endogenous\nand exogenous levels on ROS production during IVM, the addition of NO donors proved to be deleterious for maturation regardless of the variations in ROS levels. Therefore, we could conclude that an increase in NO levels in the oocyte could impair meiotic\nprogression both due to the formation of peroxynitrite or due to the inhibition of the\nmitogen activated protein kinase and the maturation promoting factor, which are involved in intracellular signal transduction systems that play a role in maturation. The inhibition of the NADPH oxidase by the addition of an enzymatic inhibitor to IVM medium showed that the inhibition of the enzyme would not generate changes in ROS\nlevels, but the consequent decrease in the generation of O2 - would affect embryo\ncleavage rate, probably due to the participation of this ROS in signalling systems involved in the process of activation. The addition of enzymatic systems to modulate hydrogen peroxide (H2O2) and O2 - levels showed that although the addition of H2O2 and O2\n?- generating systems could be deleterious for oocyte quality, the use of scavengers would alter maturation by interfering\nwith intracelular signaling systems. These results would demonstrate that certain ROS levels are necessary for bovine oocyte maturation, probably due to their participation in\nsignalling systems of the process. Using modulators of the mitochondrial respiratory chain activity we determined that\nthe ATP produced in the mitochondria would be especially important at 12 h, a period of time in which there is a high metabolic activity due to an intense protein synthesis\ncoinciding with the metaphase I ? metaphase II transition. In conclusion, we determined significant fluctuations in ROS levels during the in vitro maturation and activation of bovine oocytes. The observed variations are related to\nkey events of both processes and are relevant to increase the knowledge regarding the\ndevelopmental competence of oocytes and early embryos. These results suggest that it\nwould be important to lead future experiments in order to elucidate if the fluctuations\nobserved only respond to variations in metabolic activity or if certain ROS also play a role in intracellular regulatory or signalling systems. Moreover, further studies on the metabolic\ncontrol of parthenogenetic activation could contribute to improve the performance of\nparthenogentic embryos in different biotechnological applications such as nuclear transfer, cloning and trans genesis.Fil: Morado, Sergio Adrián. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Veterinarias. Instituto de Investigación y Tecnología en Reproducción Animal; ArgentinaEl papel de las especies reactivas del oxígeno (ROS) en los procesos relacionados\ncon la manipulación y el cultivo de gametas y embriones in vitro es controversial. Se ha\npropuesto que un adecuado nivel de (anión superóxido) O2 - sería beneficioso durante la\nmaduración in vitro (MIV) de ovocitos bovinos para aumentar su competencia de desarrollo. En concordancia, se observó un aumento gradual en los niveles de ROS\ndesde el estadio de dos células al de mórula tardía, que podría depender de los cambios\nen el metabolismo del embrión bovino durante su desarrollo. Por otro lado, diversos estudios han demostrado la expresión de genes que codifican para enzimas antioxidantes\na lo largo del cultivo in vitro de ovocitos y complejos ovocito-cumulus y sostienen que para que el embrión adquiera la competencia de desarrollo sería importante también que los\nantioxidantes sean almacenados en el ovocito (como ARNm o proteínas) durante el crecimiento y la maduración. Los reportes aparentemente contradictorios encontrados en la bibliografía y los\nresultados previos de nuestro grupo justifican la necesidad de profundizar la investigación para determinar si las ROS desempeñan un rol importante en el progreso meiótico y/o en\nla maduración citoplasmática del ovocito. Por lo tanto, el objetivo general de este trabajo fue determinar la posible fluctuación en la producción de ROS durante la maduración y\nactivación in vitro de ovocitos bovinos en presencia de diferentes moduladores y su\nrelación con los principales eventos de ambos procesos.\nEn este trabajo la producción de ROS demostró ser fluctuante durante las 22 hs de\nla maduración. Se observó una significativa disminución en la generación de ROS entre las 2 y las 18 hs, que podría corresponder a un período que demanda una alta producción\nde energía por parte de la cadena respiratoria para la síntesis de proteínas requeridas durante las fases preparatorias para los eventos principales de la MIV. En cuanto al proceso de activación, observamos que existen patrones metabólicos diferentes entre ovocitos no activados, activados por espermatozoides y activados\npartenogenéticamente. El comportamiento contrastante observado en las fluctuaciones de\nlos niveles ROS y de actividad oxidativa entre la activación mediada por espermatozoides\ny la partenogenética podría estar relacionado con la diferencia que presentan ambos tipos de activación con respecto a los picos de liberación de Ca+2. El pico único de liberación de\nCa+2 desencadenado por la activación partenogenética no sería eficiente para estimular a la mitocondria en forma consistente, siendo así responsable de la menor competencia de\ndesarrollo observada en este tipo de activación.\nMediante la modulación de los niveles de glutatión reducido (GSH) pudimos\nobservar que si bien el rol antioxidante del GSH podría ser suplido por otros componentes del sistema antioxidante del ovocito, su participación en el mantenimiento de la morfología del huso meiótico sería esencial para que se lleve a cabo la maduración.\nAl analizar el efecto de la modulación de los niveles de óxido nítrico (ON) exógeno\ny endógeno sobre la producción de ROS durante la MIV, la adición de un donante de ON demostró ser perjudicial para la maduración independientemente de las variaciones en los\nniveles de ROS. Por lo tanto, podemos concluir que un aumento en la concentración de\nON en el ovocito impediría el progreso meiótico tanto por la formación de ONOO- como por la inhibición de la enzima Map quinasa y del factor promotor de la maduración, que\nintervienen en sistemas de señalización intracelular claves para la maduración.\nMediante la adición de un inhibidor de la NADPH oxidasa al medio de MIV\ndeterminamos que la inhibición de la enzima no generaría cambios en los niveles de ROS del ovocito, pero la disminución del O2\n- generado por esta enzima afectaría la tasa de clivaje embrionario, posiblemente por la participación de este compuesto en mecanismos\nde señalización intracelular necesarios para la ctivación. Al estudiar el efecto de la adición de sistemas enzimáticos moduladores de los niveles de H2O2 y O2\n- observamos que si bien la adición de sistemas generadores de estos compuestos serían perjudiciales para la calidad del ovocito, el uso de scavengers alteraría el proceso de maduración por intervenir con diferentes mecanismos de señalización intracelular. Estos resultados estarían demostrando que determinados niveles de ROS son necesarios para que el ovocito bovino lleve a cabo la maduración\nposiblemente por participar en sistemas de señalización que intervienen en el proceso. Mediante la adición de moduladores de la actividad de la cadena respiratoria determinamos que el aporte de ATP de la respiración celular sería especialmente importante a las 12 hs, momento en el cual hay una elevada demanda de actividad\nmetabólica con una activa síntesis proteica y que coincide con la transición entre las metafases I y II.\nEn conclusión, se determinó una significativa fluctuación de los niveles de ROS a\nlo largo de la maduración y la activación de ovocitos bovinos in vitro. Las variaciones observadas tienen relación con eventos clave de ambos procesos y son relevantes para\naumentar el conocimiento respecto de la competencia de desarrollo de los ovocitos y los embriones tempranos. Estos resultados justifican la importancia de realizar futuras experiencias para dilucidar si las fluctuaciones responden solamente a las variaciones en la actividad metabólica o si determinadas ROS intervienen además en sistemas regulatorios o de señalización celular. A su vez, estudios posteriores sobre el control\nmetabólico de la activación partenogenética podrían contribuir a mejorar la performance de los embriones obtenidos mediante esta activación en diferentes aplicaciones\nbiotecnológicas como transferencia nuclear, clonación y transgénesis

La vitrificación de ovocitos por método de mínimo volumen, método potencial para la criopreservación de la gameta femenina en bovinos

La producción de ganado vacuno es una de las explotaciones más importantes de nuestro país, siendo la de mayor relevancia en la producción pecuaria. Las biotecnologías asociadas a la reproducción permiten obtener mayores progresos genéticos y disminuir la incidencia de enfermedades de transmisión sexual, entre otras aplicaciones. La vitrificación es una biotecnología que permite la criopreservación de ovocitos y embriones. Consiste en el enfriamiento ultra rápido utilizando soluciones con alta concentración de sustancias crioprotectoras que evita la formación de cristales de hielo. Sin embargo, estas altas concentraciones de crioprotectores producen daño celular principalmente por su toxicidad y su efecto osmótico. Esta biotecnología está siendo utilizada ampliamente con éxito para la criopreservación de ovocitos y embriones humanos en las clínicas de fertilidad, habiendo desplazado en la práctica al congelamiento lento. En el bovino todavía no es utilizada de forma rutinaria, a pesar de que se ha demostrado que mejora la sobrevida embrionaria luego de la criopreservación respecto al congelamiento lento tradicional.Fil: Gutnisky, Cynthia. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Unidad Ejecutora de Investigaciones en Producción Animal. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Veterinarias. Unidad Ejecutora de Investigaciones en Producción Animal; ArgentinaFil: Morado, Sergio Adrián. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Unidad Ejecutora de Investigaciones en Producción Animal. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Veterinarias. Unidad Ejecutora de Investigaciones en Producción Animal; ArgentinaFil: Gadze, Tomás. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Unidad Ejecutora de Investigaciones en Producción Animal. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Veterinarias. Unidad Ejecutora de Investigaciones en Producción Animal; ArgentinaFil: Donato, Antonella María. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Unidad Ejecutora de Investigaciones en Producción Animal. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Veterinarias. Unidad Ejecutora de Investigaciones en Producción Animal; ArgentinaFil: Cetica, Pablo Daniel. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Unidad Ejecutora de Investigaciones en Producción Animal. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Veterinarias. Unidad Ejecutora de Investigaciones en Producción Animal; Argentin

Hyaluronic acid capacitation induces intracellular signals modulated by membrane-associated adenylate cyclase and tyrosine kinase involved in bovine in vitro fertilization

Heparin is the most commonly used in vitro capacitation inducer in the bovine. However, hyaluronic acid (HA) has been recently used for capacitation induction as well as for other reproductive biotechnologies, such as sperm selection and in vitro fertilization (IVF). Our aim was to induce sperm capacitation with heparin or HA in order to study mAC and TK intracellular signals and their relation with cleavage and blastocyst rates after IVF as well as with the oxidative status of the potential bovine embryos. 2,5-dideoxyadenosine and genistein were used as mAC and TK inhibitors, respectively. Sperm capacitation was analyzed using CTC technique, sperm plasma membrane and acrosome integrity were determined using trypan blue stain and differential interference contrast, and mitochondrial activity was evaluated using fluorochrome JC-1. Cleavage rate was analyzed 48h and blastocyst production 7–8 days after IVF, while cytosolic oxidative activity was determined using RedoxSensor Red CC-1 fluorochrome 7h after IVF. When mAC and TK inhibitors were added to sperm samples, only capacitation decreased significantly both in HA and heparin treated samples (P 0.05). Sperm mitochondrial membrane potential only decreased in heparin treated samples in the presence of both inhibitors (P < 0.05). Oocytes activated with HA sperm treated samples with the addition of 2,5-dideoxyadenosine and genistein presented a lower cytosolic oxidative status than those activated with sperm treated with HA alone (P < 0.05). On the other hand, oocytes activated with heparin treated sperm samples presented a lower cytosolic oxidative status only in the presence of 2,5-dideoxyadenosine (P < 0.05). Therefore, mAC and TK present a differential participation in heparin and HA sperm induced capacitation and mitochondrial function as well as in IVF.Fil: Fernández, S.. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Veterinarias. Instituto de Investigación y Tecnología en Reproducción Animal; ArgentinaFil: Morado, Sergio Adrián. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Veterinarias. Instituto de Investigación y Tecnología en Reproducción Animal; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; ArgentinaFil: Cetica, Pablo Daniel. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Unidad Ejecutora de Investigaciones en Producción Animal. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Veterinarias. Unidad Ejecutora de Investigaciones en Producción Animal; ArgentinaFil: Córdoba, M.. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Veterinarias. Instituto de Investigación y Tecnología en Reproducción Animal; Argentin

Effect of enzymatic pro-oxidant and antioxidant systems on bovine oocyte in vitro maturation

The role of reactive oxygen species (ROS) during oocyte in vitro maturation (IVM) is still controversial. Although an increase in ROS production may cause deleterious effects in cells, these reactive species may also act as signaling molecules influencing different cell functions. The aim of this study was to examine the effect of varying endogenous ROS levels during IVM on the process of bovine oocyte maturation. To do so, different enzymatic antioxidant (catalase, or superoxide dismutase + catalase, or diphenyl iodonium) or pro-oxidant systems (xanthine + xanthine oxidase, or xanthine + xanthine oxidase + catalase) were added to the culture medium. ROS levels were determined by 2′,7′-dichlorodihydrofluorescein diacetate stain, nuclear maturation was evaluated by the presence of the metaphase II chromosome configuration at 22h of IVM and cleavage rate was recorded 48hs post- in vitro fertilization. ROS levels were only significantly increased (P<0.05) by the O2.- generating system (xanthine + xanthine oxidase + catalase), but meiotic maturation rates were significantly lower (P<0.05) in all the evaluated systems compared with the control, except for the diphenyl iodonium group. However, this last group presented a significantly lower (P<0.05) cleavage rate in comparison to the control group. These results indicate that ROS would play an essential role during oocyte maturation, since its increase or decrease beyond a physiological level significantly reduced nuclear or cytoplasmic maturation rates in bovine oocytes.Fil: Morado, Sergio Adrián. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Unidad Ejecutora de Investigaciones en Producción Animal. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Veterinarias. Unidad Ejecutora de Investigaciones en Producción Animal; Argentina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Veterinarias. Instituto de Investigación y Tecnología en Reproducción Animal; ArgentinaFil: Madrid Gaviria, Stephania. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Unidad Ejecutora de Investigaciones en Producción Animal. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Veterinarias. Unidad Ejecutora de Investigaciones en Producción Animal; ArgentinaFil: Dalvit, Gabriel Carlos. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Veterinarias. Instituto de Investigación y Tecnología en Reproducción Animal; ArgentinaFil: Cetica, Pablo Daniel. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Unidad Ejecutora de Investigaciones en Producción Animal. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Veterinarias. Unidad Ejecutora de Investigaciones en Producción Animal; Argentina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Veterinarias. Instituto de Investigación y Tecnología en Reproducción Animal; Argentin

Study of sperm evaluation parameters to estimate cryopreserved bovine semen fertility

In cattle production, reproductive biotechnologies such as artificial insemination with Cryopreserved semen samples show the same performance as insemination with fresh semen. The most representative method to evaluate semen fertilizing capability is through the results obtained by in vivo fertility. However, as it is difficult to apply this method in practice, routine laboratory tests can be used to evaluate semen quality. The aim of this work was to evaluate functional spermatic parameters in cryopreserved bovine semen samples from males presenting high and low field fertility rates. Semen samples were obtained from bulls presenting low or high fertility in a program of artificial insemination. Routine and functional parameters were determined in both groups. As regards routine tests, no significant differences were observed in progressive motility and vigor between samples of animals with high and low fertility in vivo, but differences were detected in vitality and acrosome integrity (p<0.05). Within functional tests, no differences were detected in thermo resistance and capacitation induction, but HOS test, acrosomal reaction induction and IVF showed significant differences (p<0.05). These results assert that routine parameters (progressive motility and vigor) have a limited value to predict field fertility. Therefore, the incorporation of some functional tests may offer a better estimation of fertilizing capability.Fil: Morado, Sergio Adrián. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Veterinarias. Instituto de Investigacion y Tecnología en Reproducción Animal; ArgentinaFil: Pereyra, V.. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Unidad Ejecutora de Investigaciones en Produccion Animal; ArgentinaFil: Breininger, Elizabeth. Centro de Reproducción Bovina; ArgentinaFil: Sara, R..Fil: Cetica, Pablo Daniel. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Unidad Ejecutora de Investigaciones en Produccion Animal; Argentin

Reactive oxygen species in bovine oocyte maturation in vitro

The role of reactive oxygen species (ROS) in the in vitro maturation (IVM) of oocytes remains controversial. The aim of the present study was to determine possible fluctuations in ROS production during bovine oocyte IVM in the presence of different modulators of ROS generation. Cumulus-oocyte complexes were cultured in medium 199 (control) in the absence or presence of 0.6 mm cysteine, 1mm 1-choro-2,4-dinitro benzene (CDNB), 2μm diphenyliodonium, 0.5 mm N-nitro-l-arginine methyl ester or 10 μm sodium nitroprusside (SNP) at 39°C, in 5% CO2 in humidified air for 22 h. In addition, the respiratory chain effectors potassium cyanide (KCN; 1 mm) and carbonyl cyanide m-chlorophenylhydrazone (0.42 μm) were used. Meiotic maturation was determined by the presence of MII. ROS production was evaluated in denuded oocytes at different time points as the ratio of 2′,7′- dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCHF-DA) to fluorescein diacetate (FDA). ROS levels, expressed as DCHF-DA : FDA, fluctuated throughout the 22 h of maturation depending on the treatment applied. At 12 h incubation in the presence of KCN and SNP, ROS levels were increased, whereas ROS levels after 12 h in the presence of cysteine were reduced (P < 0.05). Both CDNB and SNP impaired meiotic progression. The higher metabolic activity demand during bovine oocyte maturation coincides with a concomitant reduction in ROS generation. These results suggest that 12 h would be a critical point for bovine oocyte IVM because it is closely related to the production of ROS at this time.Fil: Morado, Sergio Adrián. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Veterinarias. Instituto de Investigacion y Tecnología en Reproducción Animal; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; ArgentinaFil: Cetica, Pablo Daniel. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Veterinarias. Instituto de Investigacion y Tecnología en Reproducción Animal; ArgentinaFil: Beconi, Martha Teresa. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Veterinarias. Instituto de Investigacion y Tecnología en Reproducción Animal; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; ArgentinaFil: Dalvit, Gabriel Carlos. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Veterinarias. Instituto de Investigacion y Tecnología en Reproducción Animal; Argentin

Effect of the hematopoietic growth factors erythropoietin and kit ligand on bovine oocyte in vitro maturation and developmental competence

The overall aim of this work was to study the influence of the hematopoietic growth factors erythropoietin (EPO) and kit ligand (KITL) during bovine oocyte in vitro maturation (IVM). The effect of adding different concentrations of EPO or KITL to maturation medium was evaluated analyzing oocyte nuclear maturation, cumulus cells apoptosis, embryo cleavage, reactive oxygen species (ROS) production in matured oocytes and cleaved embryos and the developmental competence to the blastocyst stage. No significant differences were observed in the percentage of oocytes that completed nuclear maturation among treatments, but the percentages of cleaved embryos and blastocysts obtained increased. With the addition of both hematopoietic growth factors the percentage of cumulus cells undergoing apoptosis decreased, the number of blastomeres per cleaved embryo was larger and ROS production per cleaved embryo increased. In conclusion, although the addition of EPO and KITL hematopoietic growth factors during bovine oocyte IVM had no impact on nuclear maturation, it had a positive effect on oocyte cytoplasmic maturation and developmental competence.Fil: Conde, Pamela Andrea. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Instituto de Estudios de la Inmunidad Humoral Prof. Ricardo A. Margni. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Instituto de Estudios de la Inmunidad Humoral Prof. Ricardo A. Margni; Argentina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Veterinarias. Instituto de Investigación y Tecnología en Reproducción Animal; ArgentinaFil: Morado, Sergio Adrián. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Veterinarias. Instituto de Investigación y Tecnología en Reproducción Animal; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; ArgentinaFil: Alvarez, Gabriel Martín. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Unidad Ejecutora de Investigaciones en Producción Animal. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Veterinarias. Unidad Ejecutora de Investigaciones en Producción Animal; ArgentinaFil: Smitz, Johan. Vrije Unviversiteit Brussel; BélgicaFil: Gentile, Maria Teresa. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Instituto de Estudios de la Inmunidad Humoral Prof. Ricardo A. Margni. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Instituto de Estudios de la Inmunidad Humoral Prof. Ricardo A. Margni; ArgentinaFil: Cetica, Pablo Daniel. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Unidad Ejecutora de Investigaciones en Producción Animal. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Veterinarias. Unidad Ejecutora de Investigaciones en Producción Animal; Argentin

Morphological, biochemical and functional studies to evaluate bovine oocyte vitrification

The aim of the present study was to evaluate the effect of vitrification on morphological, biochemical and functional parameters of matured bovine oocytes at different recovery times. To this end, matured bovine oocytes were vitrified using the Cryotech® kit (a minimum-volume system) and then incubated in maturation medium for different post-warming durations (0 h, 3 h or 21 h). Morphology, viability and biochemical parameters were assessed at each time point mentioned above and the recovery of the metaphase plate was analyzed at 2 h, 3 h and 4 h post-warming. The vitrification-warming process did not affect the viability or morphology of oocytes at any time point. However, the recovery of the metaphase plate occurred mostly between 3 and 4 h rather than at 2 h after warming (P < 0.05). Both control and vitrified-warmed oocytes showed changes in cytosolic oxidative activity, quantification of active mitochondria, reactive oxygen species (ROS) levels and redox status at the different time points studied (P < 0.05). However, differences between control and vitrified-warmed oocytes were found only in the quantification of active mitochondria and ROS production (P < 0.05). Finally, in vitro fertilization and embryo culture were carried out as functional studies to establish whether vitrification-warming affected oocyte competence, and a significant decrease was found both in the cleavage rate and embryo development (P < 0.05). We concluded that major improvements in oocyte vitrification, at list with Cryotech® kit, are still needed to avoid variations in oocyte metabolism which could contribute to the reduction in the developmental competence of bovine oocytes.Fil: Gutnisky, Cynthia. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Unidad Ejecutora de Investigaciones en Producción Animal. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Veterinarias. Unidad Ejecutora de Investigaciones en Producción Animal; Argentina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Veterinarias. Instituto de Investigación y Tecnología en Reproducción Animal; ArgentinaFil: Morado, Sergio Adrián. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Veterinarias. Instituto de Investigación y Tecnología en Reproducción Animal; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; ArgentinaFil: Gadze, T.. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Veterinarias. Instituto de Investigación y Tecnología en Reproducción Animal; ArgentinaFil: Donato, A.. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Veterinarias. Instituto de Investigación y Tecnología en Reproducción Animal; ArgentinaFil: Alvarez, Gabriel Martín. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Unidad Ejecutora de Investigaciones en Producción Animal. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Veterinarias. Unidad Ejecutora de Investigaciones en Producción Animal; Argentina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Veterinarias. Instituto de Investigación y Tecnología en Reproducción Animal; ArgentinaFil: Dalvit, G.. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Veterinarias. Instituto de Investigación y Tecnología en Reproducción Animal; ArgentinaFil: Cetica, Pablo Daniel. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Unidad Ejecutora de Investigaciones en Producción Animal. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Veterinarias. Unidad Ejecutora de Investigaciones en Producción Animal; Argentina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Veterinarias. Instituto de Investigación y Tecnología en Reproducción Animal; Argentin

Effects of gonadotrophins and insulin on glucose uptake in the porcine cumulus–oocyte complex during IVM

The combination of gonadotrophins (LH and FSH) and insulin is frequently used in porcine oocyte IVM, but the individual effects of gonadotrophins and insulin have not been completely studied. The aim of this study was to investigate the mechanisms involved in glucose metabolism in the swine cumulus?oocyte complex (COC), analysing the effects of gonadotrophins (10 IU/mL LH + 10 IU/mL FSH) and 0.4 uU/mL insulin, during 44 h of IVM, on glucose transport and consumption, as well as on nuclear maturation and sperm penetration. We evaluated the effects ofgonadotrophins and insulin separately or in combination on glucose consumption, membrane permeability to the glucose fluorescent analogue 6-(N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)amino)-6-deoxyglucose (6-NBDG), the presence of GLUT-4 and oocyte maturation rates, after 44 h of IVM. Nuclear maturation percentages increased significantly following the addition of gonadotrophins alone or in combination with insulin to the culture medium (P < 0.0001), whereas insulinalone had no effect. A significant increase was observed in sperm penetration of COCs matured with insulin, gonadotrophins or their combination (P , 0.0001). However, only gonadotrophins significantly increased glucose uptake (P < 0.0001). Although gonadotrophins and insulin increased GLUT-4 expression, neither modified 6-NBDG incorporation. In conclusion, gonadotrophins and insulin had different effects during IVM; although gonadotrophins increased maturation rates and glucose consumption, they had no effect on glucose transport, and insulin improved sperm penetration without affecting the parameters related to glucose utilisation. Therefore, glucose metabolism is likely to be primarily regulated by its consumption in metabolic pathways rather than by changes in membrane permeability.Fil: Alvarez, Gabriel Martín. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Unidad Ejecutora de Investigaciones en Producción Animal. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Veterinarias. Unidad Ejecutora de Investigaciones en Producción Animal; ArgentinaFil: Barrios Expósito, María Josefina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Veterinarias; ArgentinaFil: Elia, Evelin Mariel. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Ciudad Universitaria. Instituto de Fisiología, Biología Molecular y Neurociencias. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Fisiología, Biología Molecular y Neurociencias; ArgentinaFil: Paz, Dante Agustin. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Ciudad Universitaria. Instituto de Fisiología, Biología Molecular y Neurociencias. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Fisiología, Biología Molecular y Neurociencias; ArgentinaFil: Morado, Sergio Adrián. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Unidad Ejecutora de Investigaciones en Producción Animal. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Veterinarias. Unidad Ejecutora de Investigaciones en Producción Animal; ArgentinaFil: Cetica, Pablo Daniel. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Unidad Ejecutora de Investigaciones en Producción Animal. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Veterinarias. Unidad Ejecutora de Investigaciones en Producción Animal; Argentin

Resveratrol supplementation promotes recovery of lower oxidative metabolism after vitrification and warming of in vitro -produced bovine embryos

Although vitrification is the current method of choice for oocyte and embryo cryopreservation, it may have detrimental effects on reduction-oxidation status and mitochondrial activity. The aim of this study was to evaluate the effect of supplementing in vitro culture (IVC) media and/or vitrification solutions with the antioxidant resveratrol on active mitochondria, mitochondrial superoxide production and lipid peroxidation. Abattoir-derived oocytes were matured and fertilised in vitro using standard procedures. Following IVF (21 h later), zygotes were cultured in IVC medium supplemented with 0 or 0.5M resveratrol. On Day 7, blastocysts were vitrified using the Cryotech Vitrification Kit (Cryo Tech Laboratory) with or without 0.5M resveratrol. After warming, active mitochondria, mitochondrial superoxide production and lipid peroxidation were evaluated using Mito Tracker Green FM, MitoSOX Red and BODIPY 581/591 C 11 staining respectively. The vitrification-warming process significantly increased active mitochondria and mitochondrial superoxide production in bovine embryos (P < 0.05, ANOVA). The addition of 0.5M resveratrol to the IVC medium or vitrification solutions significantly attenuated the increase in active mitochondria (P < 0.05), but not in mitochondrial superoxide production, whereas embryos cultured and vitrified with resveratrol showed the highest values for both parameters (P < 0.05). Regarding lipid peroxidation, no significant differences were detected between treatments. In conclusion, resveratrol supplementation of IVC medium or vitrification solutions contributes to recovery of an embryo's 'quieter' state (i.e. lower oxidative metabolism) after vitrification. However, supplementation of both solutions with resveratrol seemed to have a pro-oxidant effect.Fil: Madrid Gaviria, Stephania. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Unidad Ejecutora de Investigaciones en Producción Animal. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Veterinarias. Unidad Ejecutora de Investigaciones en Producción Animal; ArgentinaFil: Morado, Sergio Adrián. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Unidad Ejecutora de Investigaciones en Producción Animal. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Veterinarias. Unidad Ejecutora de Investigaciones en Producción Animal; ArgentinaFil: Lopez Herrera, Albeiro. Universidad Nacional de Colombia. Sede Medellin; ColombiaFil: Betancur, Giovanni Restrepo. Universidad Nacional de Colombia. Sede Medellin; ColombiaFil: Urrego Alvarez, Rodrigo A.. Universidad Ces.; ColombiaFil: Echeverri Zuluaga, Julián. Universidad Nacional de Colombia. Sede Medellin; ColombiaFil: Cetica, Pablo Daniel. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Unidad Ejecutora de Investigaciones en Producción Animal. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Veterinarias. Unidad Ejecutora de Investigaciones en Producción Animal; Argentin