Cadmium phytotoxicity and trophic transfer to isopods

Doutoramento em BiologiaO cádmio (Cd) é um metal não essencial e é considerado um poluente prioritário pela comunidade europeia. Este metal atinge o ambiente no decurso de várias actividades antropogénicas e tende a concentrar-se nos solos e sedimentos, onde está potencialmente disponível para as plantas, sendo posteriormente transferido através da cadeia trófica. Neste contexto, o principal objectivo da presente dissertação foi o estudo dos efeitos da assimilação e da acumulação de Cd em plantas e as suas consequências para animais consumidores. Numa primeira fase, foram estudados os principais efeitos fisiológicos e genotóxicos do Cd em plantas. As plantas de alface (Lactuca sativa L.) expostas a Cd apresentaram um decréscimo na eficiência fotossintética, aumento de peroxidação lipídica e alterações significativas na actividade de enzimas de stress oxidativo. Estas alterações culminaram num decréscimo do crescimento da parte aérea no final da exposição. As respostas obtidas pelos parâmetros bioquímicos sugerem que estes poderão ser utilizados como eventuais biomarcadores em testes ecotoxicológicos com Cd em abordagens integrantes em conjunto com parâmetros clássicos. Os efeitos mutagénicos de Cd foram avaliados através da determinação da instabilidade de microsatélites (IM). Não foi observada IM, nem nas folhas nem nas raízes de plantas de alface com 5 semanas de idade expostas a 100 μM Cd durante 14 dias, no entanto observou-se IM em raízes de alface exposta a 10 μM Cd durante 28 dias desde a germinação. A idade da planta e a maior acumulação de Cd nas raízes poderão explicar os resultados obtidos. A clastogenicidade de Cd foi analisada em três espécies vegetais com diferentes capacidades de destoxificação e acumulação de metais através de citometria de fluxo. Foram detectadas alterações significativas nos parâmetros analisados em raízes alface, mas não nas espécies Thlaspi caerulescens J & C Presl e Thlaspi arvense L. Estes resultados sugerem que o stress provocado pelo Cd originou clastogenicidade como consequência da perda de porções de cromossomas, uma vez que o conteúdo de ADN nuclear diminuiu. A transferência trófica através da cadeia alimentar permanece muito pouco estudada em termos ecotoxicológicos. A distribuição subcellular de metais num organismo pode ser utilizada para compreender a transferência trófica de um metal na cadeia alimentar. Como tal, numa última parte é estudado de que modo a distribuição subcellular do Cd em plantas com perfis de acumulação de Cd distintos afecta a biodisponibilidade e transferência trófica de Cd para isópodes. A distribuição de Cd entre as 4 fracções subcelulares obtidas através de centrifugação diferencial revelou a existência de diferenças significativas entre as espécies de plantas. Estes resultados em conjunto com a avaliação directa da eficiência de assimilação (EA) de Cd individual de cada uma das quatro fracções subcelulares das plantas em estudo, resultou em informação de grande relevância para a explicação das diferenças observadas na EA de Cd por parte de isópodes alimentados com folhas de diferentes espécies de plantas. Com base nos resultados obtidos, o Cd ligado a proteínas estáveis à temperatura (e.g. metaloteoninas e fitoquelatinas) é o menos biodisponível, sendo assim o que menos contribuiu para a transferência trófica, enquanto que o Cd ligado a proteínas desnaturadas pela temperatura foi a fracção mais disponível para transferência trófica de Cd ao isópode. Estes resultados realçam a relevância ecológica da distribuição subcelular de Cd em plantas que tem influência directa na tranferência trófica deste metal para os consumidores e ainda o facto de que alterações na distribuição subcelular de Cd em plantas devido a diferentes mecanismos de destoxificação poderá ter um impacto directo na transferência trófica de Cd para o animal consumidor.Cadmium (Cd) is a non-essential metal and is considered a priority pollutant by the European Community. This metal is released to the environment as a consequence of several anthropogenic activities and tends to accumulate in soils and sediments where it is potentially available to rooted plants causing severe detrimental effects and then transferred to animals through the food chain. In this context, the main objective of the present dissertation is to study the effects of Cd uptake and accumulation in plants and its implications to animal consumers. First, the main physiologic and genotoxic effects of Cd to plants were examined. Cadmium-exposed lettuce (Lactuca sativa L.) plants displayed a significant decrease in photosynthetic efficiency, enhanced lipid peroxidation and alterations in the activities of antioxidant enzymes over the duration of exposure. These alterations culminated in reduced shoot growth at the end of the exposure. The aforementioned biochemical alterations are suggested to be used as plant biomarkers in integrative approaches with classical endpoints in future ecotoxicological tests with Cd. The mutagenic effects of Cd on plants were assessed examining microsatellite instability (MSI). No MSI was found neither in leaves nor roots of 5-week old lettuce plants exposed to 100 μM Cd, but MSI was found in roots of lettuce plants exposed to 10 μM for 28 days from seed germination. The age of the plant at the time and the higher accumulation of Cd in the roots might explain the results obtained. Clastogenic effects of Cd was examined in plants with different metal accumulation and detoxification capacities by flow cytometric (FCM). The endpoints analysed indicated significant alterations in lettuce roots but not in Thlaspi caerulescens J & C Presl and Thlaspi arvense L.. The results obtained suggested that Cd stress may have lead to clastogenic damage as a consequence of loss of chromosome portions because nDNA content was found to be diminished. Trophic transfer through the food chain remains a largely unexplored area of ecotoxicology. Subcellullar distribution of metal accumulated within an organism can be used to understand metal trophic transfer within a food chain. Thus, in a final stage we examined how Cd subcellular distribution in plants with different patterns of Cd accumulation can affect assimilation of Cd by the isopod. The distribution of Cd between the four different subcellular fractions obtained by differential centrifugation revealed significant differences between the plant species. This, together with the direct assessment of isopod Cd AE from individual subcellular fractions of the leaves of the three plant species, resulted in vital information to help explain the differences observed in Cd AE by isopods fed the different type of leaves. On the basis of our results, Cd bound to heat-stable proteins (e.g. phytochelatins and methallothionein) was the least bioavailable to isopods and contributed less to the trophic transfer of Cd, while Cd bound to heat-denatured proteins was the most trophically available to the isopod. These results point to the ecological relevance of the subcellular distribution of consumer and highlight that a shift in Cd subcellular distribution in plants due to different detoxifying mechanisms may have a direct impact in the trophic transfer of Cd to the animal consumer

Avaliação da toxicidade de contaminantes ambientais em populações naturais de Pomatoschistus microps (Krøyer, 1938)

Mestrado em Métodos Biomoleculares AvançadosNas últimas décadas tem-se verificado um aumento do nível de contaminação nos estuários e nas zonas costeiras, como consequência da actividade antropogénica. Assim sendo, o desenvolvimento de métodos de avaliação do grau de exposição e contaminação de populações naturais estuarinas revela-se da maior importância, de forma a minimizar o impacto das actividades humanas. Os biomarcadores têm sido largamente utilizados em ecotoxicologia na detecção precoce de efeitos químicos, permitindo a antecipação de alterações adversas ao nível da população e uma intervenção protectora atempada. De entre os biomarcadores potencialmente disponíveis, no presente estudo a atenção foi focada na inibição da acetilcolinesterase (ACHE), alterações da lactato desidrogenase (LDH), e indução da glutationa S-transferase (GST) e das monoxigenases associadas ao sistema P450 (P450), que têm sido demonstrados como apropriados numa vasta gama de espécies e cenários reais. O presente trabalho consistiu no desenvolvimento de uma bateria de biomarcadores em populações naturais de Pomatochistus microps (Krøyer, 1838) com o intuito de avaliar o efeito de contaminantes ambientais em estuários da zona costeira atlântica ibérica, contribuindo para esse efeito três estudos com objectivos distintos: (i) caracterização do tipo de colinesterases presentes nos tecidos da cabeça de P. microps; (ii) identificar, em P. microps, biomarcadores adequados para o contaminante ambiental 3,4-dicloroanilina (DCA); (iii) avaliação da exposição de populações naturais de P. microps a diferentes tipos de contaminação ambiental em estuários da costa noroeste portuguesa, utilizando os vários biomarcadores seleccionados. Importantes alterações verificadas a nível histológico e bioquímico por exposição à DCA indicam-na como substância potencialmente tóxica para populações naturais de P. micropsde estuários sob influência agrícola. Os resultados obtidos com a avaliação daexposição a diferentes tipos de contaminação ambiental confirmam a utilidade da abordagem de biomarcadores a diferentes níveis de organização biológica e são um contributo para a futura utilização de P. microps como biomonitor em estuários da zona costeira ibérica.In recent years, the levels of contaminants in estuaries and coastal zones increased as a consequence of anthropogenic activities. For this reason, it is a priority to develop methods to evaluate the degree of exposure and contamination of estuarine natural populations in order to minimise the impact of human activities. Biomarkers have been widely used in ecotoxicology as early warning signals of chemicals effects, offering the possibility of anticipating severe alterations at a population level and, thus, making possible a protective intervention. Among the biomarkers potentially available for use, in this study attention was focused on the inhibition of acetylcholinesterase (AChE), alterations of lactate dehydrogenase (LDH), and induction of glutathione S-transferase (GST) and the monooxygenase enzymes associated to P450 system (P450), which have been shown to be appropriate for use in a large variety of species and real scenarios. The aim of the present work was to develop a battery of biomarkers on natural populations of Pomatoschistus microps (Krøyer, 1838) in order to assess the effect of environmental contaminants in estuaries from the Atlantic Iberian coast. For this purpose three studies with distinct objectives were carried out: (i) characterization of the cholinesterase forms present in head tissues of P. microps; (ii) identification in P. micropsof suitable biomarkers to assess the environmental contaminant 3,4-dichloroaniline (DCA); (iii) assessment of different contamination impacts in estuaries of the Norwest Portuguese coast using the selected biomarkers. Exposure to DCA induced important alterations at histological and biochemical levels, that indicate this compound as potentially toxic for natural populations of P. micropsin estuaries with agricultural influence. The results obtained with the assessment of environmental contamination support the usefulness of the biomarker approach at different levels of biological organization to assess the toxicity of environmental pollution, and provide further support for the use of P. microps as a biomonitor in estuaries of the Iberian coast