In vitro screening of probiotic lactic acid bacteria and prebiotic glucooligosaccharides to select effective synbiotics

Probiotics and prebiotics have been demonstrated to positively modulate the intestinal microflora and could promote host health. Although some studies have been performed on combinations of probiotics and prebiotics, constituting synbiotics, results on the synergistic effects tend to be discordant in the published works. The first aim of our study was to screen some lactic acid bacteria on the basis of probiotic characteristics (resistance to intestinal conditions, inhibition of pathogenic strains). Bifidobacterium was the most resistant genus whereas Lactobacillus farciminis was strongly inhibited. The inhibitory effect on pathogen growth was strain dependent but lactobacilli were the most effective, especially L. farciminis. The second aim of the work was to select glucooligosaccharides for their ability to support the growth of the probiotics tested. We demonstrated the selective fermentability of oligodextran and oligoalternan by probiotic bacteria, especially the bifidobacteria, for shorter degrees of polymerisation and absence of metabolism by pathogenic bacteria. Thus, the observed characteristics confer potential prebiotic properties on these glucooligosaccharides, to be further confirmed in vivo, and suggest some possible applications in synbiotic combinations with the selected probiotics. Furthermore, the distinctive patterns of the different genera suggest a combination of lactobacilli and bifidobacteria with complementary probiotic effects in addition to the prebiotic ones. These associations should be further evaluated for their synbiotic effects through in vitro and in vivo models

Selection of CalB immobilization method to be used in continuous oil transesterification: Analysis of the economical impact

Enzymatic transesterification of triglycerides in a continuous way is always a great challenge with a large field of applications for biodiesel, bio-lubricant, bio-surfactant, etc. productions. The lipase B from Candida antarctica (CalB) is the most appreciated enzyme because of its high activity and its non-regio-selectivity toward positions of fatty acid residues on glycerol backbone of triglycerides. Nevertheless, in the field of heterogeneous catalysis, we demonstrated that the medium hydrophilic nature of the support used for its commercial form (Lewatit VPOC1600) is a limitation. Glycerol is adsorbed onto support inducing drastic decrease in enzyme activity. Glycerol would form a hydrophilic layer around the enzyme resulting in diffusional limitations during triglyceride transfer to the enzyme. Accurel MP, a very hydrophobic macroporous polymer of propylene, was found not to adsorb glycerol. Immobilization conditions using this support were optimized. The best support was Accurel MP1001 (particle size<1000μm) and a pre-treatment of the support with acetone instead of ethanol enables the adsorption rate and the immobilized enzyme quantity to be maximized. An economical approach (maximization of the process net present value) was expanded in order to explore the impact of immobilization on development of an industrial packed bed reactor. The crucial ratio between the quantity of lipase and the quantity of support, taking into account enzyme, support and equipped packed bed reactor costs was optimized in this sense. The biocatalyst cost was found as largely the main cost centre (2–10 times higher than the investments for the reactor vessel). In consequence, optimal conditions for immobilization were a compromise between this immobilization yield (90% of lipase immobilized), biocatalyst activity, reactor volume and total investments

Metabolic adaptation to a high-fat diet is associated with a change in the gut microbiota

Objective The gut microbiota, which is considered a causal factor in metabolic diseases as shown best in animals, is under the dual influence of the host genome and nutritional environment. This study investigated whether the gut microbiota per se, aside from changes in genetic background and diet, could sign different metabolic phenotypes in mice. Methods The unique animal model of metabolic adaptation was used, whereby C57Bl/6 male mice fed a high-fat carbohydrate-free diet (HFD) became either diabetic (HFD diabetic, HFD-D) or resisted diabetes (HFD diabetes-resistant, HFD-DR). Pyrosequencing of the gut microbiota was carried out to profile the gut microbial community of different metabolic phenotypes. Inflammation, gut permeability, features of white adipose tissue, liver and skeletal muscle were studied. Furthermore, to modify the gut microbiota directly, an additional group of mice was given a glucooligosaccharide (GOS)-supplemented HFD (HFD+GOS). Results Despite the mice having the same genetic background and nutritional status, a gut microbial profile specific to each metabolic phenotype was identified. The HFD-D gut microbial profile was associated with increased gut permeability linked to increased endotoxaemia and to a dramatic increase in cell number in the stroma vascular fraction from visceral white adipose tissue. Most of the physiological characteristics of the HFD-fed mice were modulated when gut microbiota was intentionally modified by GOS dietary fibres. Conclusions The gut microbiota is a signature of the metabolic phenotypes independent of differences in host genetic background and diet

Les connaissances nécessaires à la biologie industrielle

La biologie industrielle résulte de la convergence des sciences de la vie et des sciences de l’ingénieur.Elle est le fruit de l’extraordinaire avancée des connaissances et des outils disponiblesdans les deux domaines précités : diminution du coût du séquençage des génomes (et dans unemoindre mesure de la synthèse de gènes), augmentation de la puissance de calcul disponibleet des possibilités de modélisation, amélioration des méthodologies et des outils biologiques etanalytiques… La combinaison de ces progrès a conduit à l’émergence de la biologie synthétique,c’est-à-dire à la possibilité de remanier rationnellement le génome d’un microorganisme en yintroduisant notamment des systèmes de régulation et des activités enzymatiques non décritesdans les systèmes vivants, de manière à créer des voies métaboliques originales. Des succèsindustriels ont d’ores et déjà été enregistrés (hydrocortisone, acide artémisinique, propane-1,3-diol, acide succinique…)

CARACTERISATION DE MICRO-ORGANISMES THERMOPHILES DE LA RIDE MEDIO-ATLANTIQUE. DESCRIPTION DE DEUX NOUVEAUX GENRES BACTERIENS

A PARTIR D'ECHANTILLONS MINERAUX ET ANIMAUX DES SITES HYDROTHERMAUX DE LA RIDE MEDIO-ATLANTIQUE, UNE COLLECTION DE 80 ISOLATS THERMOPHILES HETEROTROPHES A ETE CONSTITUEE. LES CULTURES D'ENRICHISSEMENT ONT ETE OBTENUES EN PLACANT CES ECHANTILLONS DANS DES CONDITIONS D'ANAEROBIOSE ET DE THERMOPHILIE, ET DANS DIFFERENTS MILIEUX A BASE DE GLUCIDES (CELLOBIOSE, AMIDON, XYLANE, DEXTRANE), DE LIPIDES ET/OU DE PROTEINES, SUBSTRATS DONT LA BIODEGRADATION POSSEDE UN INTERET INDUSTRIEL. LA CARACTERISATION, PAR DES OUTILS DE BIOLOGIE MOLECULAIRE, D'UNE PARTIE DE LA COLLECTION, A PERMIS D'EN APPREHENDER LA BIODIVERSITE. LES TECHNIQUES QUI ONT ETE MISES EN UVRE SONT LES SUIVANTES : PCR-RFLP SUR L'ADNR 16S (ARDRA), RAPD ET SEQUENCAGE DE L'ADNR 16S. CETTE APPROCHE A PERMIS DE SEPARER LES ISOLATS DE LA COLLECTION EN 9 UNITES TAXONOMIQUES OPERATIONNELLES (OTU), 6 RASSEMBLANT DES SOUCHES D'ARCHAEA, 3 DES SOUCHES BACTERIENNES. LE SEQUENCAGE DE L'ADNR 16S DE QUELQUES ISOLATS REPRESENTATIFS DE CES GROUPES A MONTRE QUE PLUSIEURS GENRES DIFFERENTS DE PROCARYOTES THERMOPHILES ETAIENT REPRESENTES DANS LA COLLECTION, DONT LES GENRES THERMOCOCCUS, PYROCCOCUS ET THERMOSIPHO. DES ETUDES PHYLOGENETIQUES BASEES SUR LA COMPARAISON DES SEQUENCES D'ADNR 16S ONT PERMIS D'ETABLIR LA PRESENCE D'ISOLATS APPARTENANT A DES ESPECES NOUVELLES, VOIRE A DES GENRES NOUVEAUX D'ARCHAEA OU DE BACTERIES THERMOPHILES. L'ISOLAT MV1075 APPARTIENT A UNE NOUVELLE ESPECE D'UN NOUVEAU GENRE DE L'ORDRE DES THERMOTOGALES : MARINITOGA CAMINATA. L'ISOLAT MV1087 A ETE SOUMIS A L' INTERNATIONAL JOURNAL OF SYSTEMATIC AND EVOLUTIONARY MICROBIOLOGY COMME QUE SOUCHE TYPE D'UNE NOUVELLE ESPECE D'UN NOUVEAU GENRE DE BACTERIE THERMOPHILE DE L'ORDRE DES CLOSTRIDIALES : CALORANAEROBACTER AZORENSIS. CETTE SOUCHE A PAR AILLEURS FAIT L'OBJET D'UNE ETUDE DE CROISSANCE SOUS PRESSION HYDROSTATIQUE (DE 0.5 A 65 MPA) MENEE AU JAMSTEC (YOKOSUKA, JAPON). CETTE ETUDE A MONTRE QUE L'ESPECE C. AZORENSIS ETAIT BAROTOLERANTE, ET ADAPTEE A LA PRESSION DE SON POINT DE PRELEVEMENT. ENFIN, CONCERNANT LES POTENTIALITES INDUSTRIELLES DE LA COLLECTION, L'EFFET DU SUBSTRAT CARACTERISTIQUE DU MILIEU D'ENRICHISSEMENT (AMIDON, XYLANE ETC) A ETE TESTE SUR LA CROISSANCE DES DIFFERENTS ISOLATS. CECI A PERMIS DE SELECTIONNER UNE DIZAINE D'ISOLATS SUSCEPTIBLES DE POSSEDER LES ACTIVITES ENZYMATIQUES RECHERCHEES.TOULOUSE-INSA (315552106) / SudocSudocFranceF

Contribution à l amélioration du procédé d élaboration de la tequila par l utilisation d enzymes

Les objectifs de ce travail étaient : (i) la substitution, dans un procédé d élaboration de tequila, du traitement chimique du jus de cuisson de l agave appliqué pour hydrolyser les fructanes non dégradés lors de la cuisson et rendre tous les sucres disponibles - par un traitement enzymatique, (ii) sa validation au niveau industriel, (iii) l évaluation de l utilisation d enzymes de dégradation de la paroi végétale pour faciliter l étape de pressage de l agave. Les bilans sur les sucres de la distillerie étudiée ont d abord été validés. Puis, l hydrolyse des fructanes au cours de la cuisson de l agave a été caractérisée. Un échantillonnage du jus de cuisson prêt à être soumis au traitement hydrolytique supplémentaire a ensuite été réalisé, et le jus le moins hydrolysé a été sélectionné pour l optimisation. Un lot de fructanes d agave a alors été préparé, et sa caractérisation a confirmé la nature complexe des fructanes d agave. L action de trois préparations de fructanases sur ce substrat a été étudiée. Les résultats ont montré que la préparation d endo et exo-inulinases sélectionnée était capable d hydrolyser totalement les fructanes d agave. La cinétique d action de cette préparation sur ce substrat a alors été étudiée, et les résultats ont permis d optimiser le traitement du jus de cuisson. L utilisation de cette préparation au cours de deux essais industriels a permis de valider les conditions optimisées au laboratoire, tant d un point de vue pratique et économique que sur les qualités du produit fini. Enfin, 12 préparations d enzymes de dégradation de la paroi végétale ont été testées sur agave cuit. Les résultats ont montré une augmentation significative de la quantité de sucres récupérés dans le jus de presseThe objectives of this work were: (i) the substitution, in a tequila elaboration process, of the chemical treatment of agave cooking juice applied to hydrolyze fructans non-degraded by cooking and liberate all sugars for an enzymatic treatment, (ii) the validation of this treatment at an industrial level, (iii) the evaluation of the use of degrading plant cell wall enzymes to facilitate the agave milling step. The sugar balance of the studied distillery was first validated. Fructan hydrolysis during agave cooking was then characterized. A sampling of cooking juice ready to be submitted to the supplementary hydrolytic treatment was then carried out, and the least hydrolyzed juice was selected for optimization. A pool of agave fructans was then prepared, and its characterization confirmed the complex nature of agave fructans. The action of three fructanase preparations on this substrate was studied. The results showed that the selected preparation of endo and exoinulinases was able to completely hydrolyze agave fructans. The action kinetic of the preparation on this substrate was then studied, and the results allowed optimizing the cooking juice treatment. The use of this preparation during two industrial trials allowed the validation of the optimized conditions, from a practical and economical point of view as well as with respect to the organoleptic qualities of the final product. Finally, 12 preparations of plant cell wall degrading enzymes were tested on cooked agave. The results showed a significant increase of the quantity of sugars recovered in the milling juiceTOULOUSE-INSA (315552106) / SudocSudocFranceF

Glucane-saccharases optimisées pour la glucosylation de molécules intervenant dans la composition de vaccins

La synthèse d oligosides complexes et glycoconjugués reste difficilement réalisable par voie chimique, freinant ainsi l exploitation de ces molécules à grande échelle. Le recours aux catalyseurs enzymatiques apparaît comme une alternative prometteuse mais les enzymes naturelles ne présentent pas toujours les propriétés adéquates, en particulier sur le plan de leurs spécificités, pour être intégrées dans des voies de synthèse chimio-enzymatiques. Le défi de cette thèse a consisté a mettre à profit les techniques d ingénierie enzymatique pour concevoir des glyco-enzymes déployant de nouvelles spécificités, produire à façon des intermédiaires de synthèse chimique et ouvrir la voie à de nouveaux procédés d obtention d oligosides d intérêt thérapeutique. Il s agissait de développer de nouvelles transglucosidases capables de glucosyler des dérivés de la N-acétyl-D-glucosamine et du L-rhamnose pour produire des disaccharides n existant pas dans la nature mais pouvant entrer dans une voie de synthèse chimique destinées à synthétiser des haptènes oligosaccharidiques mimant les motifs antigéniques des lipopolysaccharides des sérotypes 1b et 3a de Shigella flexneri. A terme, l objectif est de développer un vaccin multivalent de troisième génération contre ces pathogènes, responsables du décès de milliers de personnes chaque année dans le monde. Pour relever ce défi, nous avons tout d abord évalué le potentiel de quatre glucane-saccharases sauvages, spécifiques de la synthèse de liaisons osidiques distinctes, à glucosyler les accepteurs cibles. Les résultats obtenus ont montré qu aucune des enzymes testées ne catalysait efficacement la réaction attendue. Cette étude préliminaire a cependant permis de sélectionner l amylosaccharase de Neisseria polysaccharea, comme enzyme candidate au développement de biocatalyseurs à stéréo- et régio-spécificités contrôlées. Le remodelage du catalyseur a été guidé par l analyse des modèles des complexes enzyme:accepteur. Sept acides aminés situés dans le site de fixation de l accepteur (sous-site +1) ont été identifiés et individuellement remplacés par les 19 acides aminés possibles par mutagénèse dirigée. Une banque de 133 mutants a été créée qui renfermait 43 mutants d intérêt pour les réactions de glucosylation considérées. Notamment, le mutant I228Y a révélé une toute nouvelle régio-spécificité vis-à-vis de l a-methyl L-rhamnopyranose. Il s agit du premier exemple de création de nouvelle spécificité pour les enzymes de cette famille et plus largement pour des a-transglycosidases. Le mutant F290K, également isolé dans cette première librairie, s est montré capable de glucosyler l a-allyl N-acétyl-D-glucoamine avec une efficacité catalytique 130 fois plus élevée que celle observée avec l enzyme sauvage. Ces deux nouvelles enzymes ont été employées pour la synthèse des disaccharides ciblés et la validation de la voie chimio-enzymatique proposée pour la synthèse des haptènes saccharidiques. Cette stratégie a été poursuivie par la construction de banques de double-mutants permettant de générer une diversité plus importante, focalisée sur ces positions, et rechercher des effets synergiques entre les différentes mutations pour améliorer la réaction de glucosylation des accepteurs cibles. Vingt double-mutants ont pu être ainsi identifiésThe difficult access to complex carbohydrates and glycoconjugates by chemical synthesis impairs their development on a large scale. Therefore, the use of biocatalysts appears as an appealing alternative, yet poorly exploited in spite of the fast-growing development of engineering technologies allowing the search and the construction of better performing enzymes, displaying novel specificities. The objective of this thesis aimed to apply enzyme engineering techniques to conceive novel glyco-enzymes well-adapted for the glucosylation of naturally non- or poorly recognized molecules (N-acetyl-D-glucosamine and L-rhamnose derivatives fulfilling the subsequent chemical step requisites). The glucosylated motives obtained via the enzymatic route, and corresponding to the serotype-specific branched -D-glucopyranosyl linkages of Shigella flexneri 2a, 1b and 3a, are subsequently elongated through a chemical synthetic pathway to synthesize the antigenic oligosaccharides. This chemo-enzymatic road could open the way to oligosaccharide haptens at low cost, that could in the future be used in the development of a third-generation vaccine against S. flexneri 1b and 3a. In a first study, we have evaluated the potential of four wild-type glucansucrases, specific for the synthesis of distinct osidic linkages, to glucosylate both types of targeted acceptors. Our preliminary results demonstrated that none of the tested glucansucrases allowed an efficient glucosylation of the target acceptors with the desired linkage specificity. On the basis of these results, amylosucrase from Neisseria polysaccharea was chosen as a candidate enzyme for the development of biocatalysts with controlled stereo- and regio-specificities that could enable the glucosylation of both types of acceptors of interest. A semi-rational approach based on the engineering of the acceptor binding site (subsite +1) was undertaken to evolve this enzyme. By individually exploring 7 positions of the active site using site-directed mutagenesis, the strategy led to the isolation of 47 mutants of interest for the considered glucosylation reactions (over the 133 generated mono-mutants) and to the identification of 2 key positions (228 and 290). Noteworthy, I228Y mutant displayed an entirely novel regio-specificity towards the -methyl L-rhamnopyranose and in the presence of allyl N-acetyl-D-glucosamine, F290K mutant permitted a 130 fold enhancement of catalityc efficiency compared to wild-type amylosucrase. This strategy was further pursued with the construction of double-mutant libraries enabling the generation of an enlarged diversity, focused on the identified positions, to investigate the synergistic effects between the different mutations in order to improve the glucosylation reactions of the target acceptors. Twenty double-mutants were thus identifiedTOULOUSE-INSA (315552106) / SudocSudocFranceF

Adaptation des procédés, biotechnologies blanches

International audienceLes futures innovations dans le domaine des biotechnologies blanches seront déterminantes pour l'émergence de bioraffineries. En effet, seules ces technologies, qui exploitent à l'échelle industrielle toute la puissance des systèmes vivants, peuvent apporter des outils et des procédés à la fois performants, propres et durables pour répondre à ce défi industriel majeur