Analisi di polimorfismi nel promotore del gene NF-E2-related factor 2 (Nrf2) e di biomarcatori di stress ossidativo in pazienti affetti da Sclerosi Laterale Amiotrofica .

RIASSUNTO La Sclerosi Laterale Amiotrofica (SLA) è una patologia neurodegenerativa caratterizzata da una progressiva e selettiva perdita dei motoneuroni a livello della corteccia motoria primaria, del tronco cerebrale e del midollo spinale. L’eziologia e la patogenesi della forma sporadica di SLA (SLAs) sono ancora in gran parte da chiarire. La SLAs viene considerata una malattia degenerativa multifattoriale, nella quale la morte cellulare sembra essere conseguenza della complessa interazione tra fattori di suscettibilità genetica e fattori ambientali. Per spiegare la morte neuronale sono state proposte diverse ipotesi, tra le quali le più accreditate chiamano in causa l’eccitotossicità glutammatergica, le alterazioni mitocondriali e lo stress ossidativo (Rothstein et al., 2009). Quest’ultimo sembra essere coinvolto nei meccanismi di neurodegenerazione che si manifestano nella SLAs, ma resta comunque da chiarire se lo stress ossidativo sia una causa della degenerazione neuronale o ne sia una conseguenza diretta. Durante la respirazione aerobica, il metabolismo cellulare e la difesa contro agenti patogeni vengono prodotte specie reattive dell’ossigeno e dell’azoto (ROS e RNS); a concentrazioni fisiologiche, ROS e RNS giocano un’importante funzione come mediatori e regolatori cellulari, ma ad elevati livelli portano inizialmente ad alterazioni nell’equilibrio redox cellulare e, in fine, allo sviluppo della condizione nota come stress ossidativo (Niedzielska et al., 2015). L’organismo umano, al fine di neutralizzare tali sostanze tossiche, ha sviluppato una pletora di meccanismi di difesa (Lee et al., 2005; Sykiotis e Bohmann, 2010). Tra questi, la via mediata dal fattore di trascrizione Nuclear factor erythroid 2-related factor 2 (Nfe2l2), noto anche come Nfr2, è attualmente riconosciuta come uno dei principali pathway di difesa cellulare contro lo stress indotto sia da sostanze pro-ossidanti che xenobiotiche (Friling et al., 1990; Li et al., 1992; Rushmore et al., 1991). Nrf2, tramite il legame ad una sequenza nucleotidica chiamata Antioxidant Response Element (ARE), modula l’attivazione trascrizionale dei suoi geni bersaglio (Rushmore et al., 1991); tra questi sono presenti geni che codificano per enzimi antiossidanti e per enzimi di detossificazione di fase II (Kundu e Surh, 2008). Il coinvolgimento di Nrf2 nell’espressione, sia basale che inducibile, dei geni ARE-dipendenti lo rende il principale regolatore della risposta antiossidante e un modulatore di numerosi processi, quali la risposta immunitaria ed infiammatoria, il rimodellamento tissutale e la proliferazione cellulare (Hyberston et al., 2011). Sono stati identificati, nella regione del promotore di NRF2, tre polimorfismi a singolo nucleotide (SNPs), -653A>G -651G>A e -617C>A, in grado di modulare l’espressione e la funzione del gene stesso (Marzec et al., 2007). Diverse evidenze in letteratura hanno dimostrato l’implicazione di Nrf2 in molti meccanismi patogenetici coinvolti nella neurodegenerazione (Johnson et al., 2010; Pareek et al., 2011; Stack et al., 2010; Kim et al., 2013; Lou et al., 2014; Sarlette A. et al, 2008; Tanji et al., 2013; Bergstrom et al. 2014; Vargas M.R. et al., 2008). In particolare, è stata riportata un’associazione fra l’aplotipo GAGCAAAA, contenente i tre alleli comuni in corrispondenza dei siti polimorfici -653A>G, -651G>A e -651C>A, ed un ritardo di 4.6 anni nell’insorgenza della Malattia di Parkinson (PD), sia in una popolazione svedese che in una polacca (Von Otter M. et al., 2010); successivamente, la variante allelica -653G è stata associata con un aumento del rischio di sviluppare PD in un’estesa coorte di pazienti italiani, maltesi e tedeschi (Von Otter et al., 2014). Inoltre, Bergstrom e collaboratori hanno osservato l’associazione fra l’aplotipo GAGCAGA e un ritardo di 4 anni nell’età di insorgenza della SLA (Bergstrom et al., 2014). In base a tali presupposti, lo scopo del presente lavoro di tesi è stato quello di valutare una possibile associazione tra i polimorfismi -653 A>G, -651 G>A e -617 C>A, presenti nel promotore del gene NRF2, e il rischio di insorgenza di SLA e la loro possibile implicazione nei meccanismi molecolari che sono alla base della risposta cellulare allo stress ossidativo. A tal fine abbiamo valutato: • la distribuzione delle frequenze alleliche e genotipiche dei tre polimorfismi funzionali -653 A>G, -651 G>A e -617 C>A in 140 pazienti SLAs e 134 controlli sani; la genotipizzazione è stata condotta mediante sequenziamento automatico diretto della regione di DNA di interesse. • i livelli plasmatici di alcuni biomarcatori di stress ossidativo, determinati tramite metodi spettrofotometrici; in particolare, come marker di danno ossidativo, sono stati dosati i Prodotti di Ossidazione Avanzata alle Proteine (AOPP) e, come markers antiossidanti non enzimatici, la Capacità Antiossidante Ferro Riducente (FRAP) e i gruppi tiolici totali plasmatici. Inoltre, come markers antiossidanti enzimatici, sono stati valutati, in 28 pazienti SLAs e in 10 controlli sani, l’attività totale dell’enzima Superossido Dismutasi (Sod) e della Catalasi (Cat). • la possibile influenza delle varianti alleliche rare -653G, -651A e -617A sui livelli plasmatici dei marcatori di stress ossidativo, sia nella popolazione totale che nelle popolazioni di pazienti e controlli separatamente, suddividendo i soggetti in base al genotipo per ogni polimorfismo oggetto di studio. • L’eventuale associazione dei polimorfismi funzionali presenti nel promotore con le caratteristiche cliniche dei pazienti, in particolare forma clinica (bulbare o spinale), durata media di malattia, età di esordio e punteggio dell’“ALS Functional Rating Scale” (ALSFRS). L’analisi dei dati relativi allo SNP -653A>G mostra associazione tra la variante allelica rara -653G e un aumento del rischio di malattia (OR 0.95 IC95% 0.58-1.57); relativamente ai polimorfismi -651 G>A e -617 C>A non abbiamo riscontrato differenze significative nella distribuzione genotipica e nelle frequenze alleliche dei pazienti con SLAs rispetto ai relativi controlli. In relazione all’eventuale associazione dei polimorfismi studiati con le caratteristiche cliniche dei pazienti i risultati ottenuti mostrano che lo SNP -653A>G non influenza né la forma clinica (bulbare o spinale) né il punteggio dell’ALSFRS; nonostante non siano state evidenziate differenze significative della durata di malattia tra i gruppi genotipici, si nota comunque una riduzione di tale parametro (rispettivamente di 11 e 18 mesi) nei portatori dei genotipi -653AG e -653GG rispetto ai pazienti con genotipo -653AA. Dall’analisi dei dati relativi allo stress ossidativo emerge che i livelli plasmatici degli AOPP risultano essere più elevati nei pazienti SLAs rispetto ai controlli (p<0.001), mentre i livelli dei tioli sono ridotti nei primi rispetto ai secondi (p<0.001). In relazione agli enzimi antiossidanti è stata osservata un’elevata attività della SOD nei pazienti rispetto ai controlli (p<0.001). Per quanto riguarda la FRAP e la catalasi non sono state riscontrate differenze tra i due gruppi di studio. Suddividendo i soggetti della nostra popolazione di studio nei portatori dei tre genotipi generati dal polimorfismo -653G>A i nostri risultati mostrano un aumento significativo dei livelli plasmatici degli AOPP e della FRAP nei portatori del genotipo -653AG rispetto ai soggetti -653AA sia nella popolazione totale che nel gruppo dei pazienti, mentre non si riscontrano differenze in quello dei controlli. Al contrario, i livelli plasmatici dei gruppi tiolici totali risultano ridotti nei soggetti -653AG rispetto a quelli -653AA, nella popolazione totale; un trend di riduzione con andamento simile è stato riscontrato solo nei pazienti, seppure non venga raggiunta la significatività. Non sono emerse differenze significative tra i livelli dei biomarcatori misurati nei portatori dei genotipi derivanti dagli SNPs -651G>A e -617C>A. I risultati, inoltre, mostrano un aumento significativo dell’attività della SOD nei soggetti -617CA rispetto ai -617CC e nei soggetti -651GG rispetto ai -651GA, lo stesso trend si osserva per la CAT. Non si osservano variazioni nell’attività dei due enzimi in relazione ai genotipi generati dal polimorfismo -653A>G. In conclusione, i dati ottenuti nel presente lavoro di tesi indicano la variante allelica -653G è associata ad un aumento del rischio di malattia. Inoltre, si osserva la presenza di un alterato equilibrio redox nei pazienti SLAs così come un legame tra il genotipo -653AG e la condizione di stress ossidativo. In base ai risultati ottenuti possiamo ipotizzare che la presenza dell’allele -653G conduca ad un deficit di espressione della proteina Nrf2 con alterazione del pathway Nrf2-ARE e conseguente attenuazione della risposta antiossidante cellulare. Ciò può indurre un accumulo di ROS che risulta deleterio soprattutto a livello neuronale, data l’elevata sensibilità del SNC. Diversi studi in letteratura hanno dimostrato come la sovraespressione indotta di Nrf2 conferisca neuroprotezione attraverso un incremento della produzione di enzimi antiossidanti indispensabili per la difesa contro lo stress ossidativo cerebrale (Vargas et al., 2008; Stack et al., 2010; Lou et al., 2014; Yang et al., 2014). Possiamo quindi ipotizzare che molecole induttrici di Nrf2 potrebbero essere utilizzate come trattamento per migliorare le difese cellulari in risposta a stress ossidativo ed infiammatorio anche nei pazienti affetti di SLA.

Microphysiological Drug-Testing Platform for Identifying Responses to Prodrug Treatment in Primary Leukemia

Despite increasing survival rates of pediatric leukemia patients over the past decades, the outcome of some leukemia subtypes has remained dismal. Drug sensitivity and resistance testing on patient-derived leukemia samples provide important information to tailor treatments for high-risk patients. However, currently used well-based drug screening platforms have limitations in predicting the effects of prodrugs, a class of therapeutics that require metabolic activation to become effective. To address this issue, a microphysiological drug-testing platform is developed that enables co-culturing of patient-derived leukemia cells, human bone marrow mesenchymal stromal cells, and human liver microtissues within the same microfluidic platform. This platform also enables to control the physical interaction between the diverse cell types. Herein, it is made possible to recapitulate hepatic prodrug activation of ifosfamide in their platform, which is very difficult in traditional well-based assays. By testing the susceptibility of primary patient-derived leukemia samples to the prodrug ifosfamide, sample-specific sensitivities to ifosfamide in primary leukemia samples are identified. The microfluidic platform is found to enable the recapitulation of physiologically relevant conditions and the testing of prodrugs including short-lived and unstable metabolites. The platform holds great potential for clinical translation and precision chemotherapy selection

Multiregional sequencing of IDH-WT glioblastoma reveals high genetic heterogeneity and a dynamic evolutionary history

Glioblastoma is one of the most common and lethal primary neoplasms of the brain. Patient survival has not improved significantly over the past three decades and the patient median survival is just over one year. Tumor heterogeneity is thought to be a major determinant of therapeutic failure and a major reason for poor overall survival. This work aims to comprehensively define intra- and inter-tumor heterogeneity by mapping the genomic and mutational landscape of multiple areas of three primary IDH wild-type (IDH-WT) glioblastomas. Using whole exome sequencing, we explored how copy number variation, chromosomal and single loci amplifications/deletions, and mutational burden are spatially distributed across nine different tumor regions. The results show that all tumors exhibit a different signature despite the same diagnosis. Above all, a high inter-tumor heterogeneity emerges. The evolutionary dynamics of all identified mutations within each region underline the questionable value of a single biopsy and thus the therapeutic approach for the patient. Multiregional collection and subsequent sequencing are essential to try to address the clinical challenge of precision medicine. Especially in glioblastoma, this approach could provide powerful support to pathologists and oncologists in evaluating the diagnosis and defining the best treatment option

Clinical validation of full HR-HPV genotyping HPV Selfy assay according to the international guidelines for HPV test requirements for cervical cancer screening on clinician-collected and self-collected samples

Background According to international guidelines, Human Papillomavirus (HPV) DNA tests represent a valid alternative to Pap Test for primary cervical cancer screening, provided that they guarantee balanced clinical sensitivity and specificity for cervical intraepithelial neoplasia grade 2 or more (CIN2+) lesions. The study aimed to assess whether HPV Selfy (Ulisse BioMed - Trieste, Italy), a full-genotyping HPV DNA test that detects and differentiates 14 high-risk HPV (HR-HPV) types, meets the criteria for primary cervical cancer screening described in the international guidelines, on clinician-collected as well as on self-collected samples. Methods For each participant woman, consecutively referring to Azienda Sanitaria Universitaria Giuliano Isontina (Trieste, Italy) and CRO-National Cancer Institute (Aviano, Italy) for the cervical cancer screening program, the following samples were tested: (a) a clinician-collected cervical specimen, analyzed with the reference test (Hybrid Capture (R) 2 test, HC2) and HPV Selfy; and (b) a self-collected vaginal sample, analyzed with HPV Selfy. Enrolled women were also asked to fulfill a questionnaire about self-sampling acceptability. As required by guidelines, a non-inferiority test was conducted to compare the clinical performance of the test under evaluation with its reference test. Results HPV Selfy clinical sensitivity and specificity resulted non-inferior to those of HC2. By analysis of a total of 889 cervical liquid-based cytology samples from a screening population, of which 98 were from women with CIN2+, HPV Selfy showed relative sensitivity and specificity for CIN2+ of 0.98 and 1.00 respectively (non-inferiority score test: P = 0.01747 and P = 0.00414, respectively); the test reached adequate intra- and inter-laboratory reproducibility. Moreover, we demonstrated that the performance of HPV Selfy on self-collected vaginal samples was non-inferior to the performance obtained on clinician-collected cervical specimen (0.92 relative sensitivity and 0.97 relative specificity). Finally, through HPV Selfy genotyping, we were able to describe HPV types prevalence in the study population. Conclusions HPV Selfy fulfills all the requirements of the international Meijer's guidelines and has been clinically validated for primary cervical cancer screening purposes. Moreover, HPV Selfy has also been validated for self-sampling according to VALHUDES guidelines. Therefore, at date, HPV Selfy is the only full-genotyping test validated both for screening purposes and for self-sampling. Trial registration ASUGI Trieste n. 16008/2018; CRO Aviano n.17149/201

Clinical features and outcomes of elderly hospitalised patients with chronic obstructive pulmonary disease, heart failure or both

Background and objective: Chronic obstructive pulmonary disease (COPD) and heart failure (HF) mutually increase the risk of being present in the same patient, especially if older. Whether or not this coexistence may be associated with a worse prognosis is debated. Therefore, employing data derived from the REPOSI register, we evaluated the clinical features and outcomes in a population of elderly patients admitted to internal medicine wards and having COPD, HF or COPD + HF. Methods: We measured socio-demographic and anthropometric characteristics, severity and prevalence of comorbidities, clinical and laboratory features during hospitalization, mood disorders, functional independence, drug prescriptions and discharge destination. The primary study outcome was the risk of death. Results: We considered 2,343 elderly hospitalized patients (median age 81&nbsp;years), of whom 1,154 (49%) had COPD, 813 (35%) HF, and 376 (16%) COPD + HF. Patients with COPD + HF had different characteristics than those with COPD or HF, such as a higher prevalence of previous hospitalizations, comorbidities (especially chronic kidney disease), higher respiratory rate at admission and number of prescribed drugs. Patients with COPD + HF (hazard ratio HR 1.74, 95% confidence intervals CI 1.16-2.61) and patients with dementia (HR 1.75, 95% CI 1.06-2.90) had a higher risk of death at one year. The Kaplan-Meier curves showed a higher mortality risk in the group of patients with COPD + HF for all causes (p = 0.010), respiratory causes (p = 0.006), cardiovascular causes (p = 0.046) and respiratory plus cardiovascular causes (p = 0.009). Conclusion: In this real-life cohort of hospitalized elderly patients, the coexistence of COPD and HF significantly worsened prognosis at one year. This finding may help to better define the care needs of this population

Cross-talk between pathogenic mechanisms in neurodegeneration: the role of oxidative stress in Amyotrophic Lateral Sclerosis

The mechanisms underlying motoneuron degeneration in amyotrophic lateral sclerosis (ALS), a neurodegenerative disorder that affects the motor system with progressive paralysis, are complex and not yet fully understood. It is generally agreed that ALS is a multifactorial and multisystem disease due not only possibly to genetic causes but also to other factors like oxidative stress, mitochondrial dysfunction, protein aggregation, RNA dysmetabolism, autophagy, and excitotoxicity glutamate-mediate. Altered oxidative stress biomarker profile has been repeatedly reported in ALS patients, which may suggest that abnormal free radical production is relevant in the ALS pathogenesis. This review aims to investigate how oxidative stress can affect other proposed mechanisms of neurodegeneration in ALS

Unveiling a sudden unexplained death case by whole exome sequencing and bioinformatic analysis

Abstract Background Sudden unexplained death (SUD) refers to cases of sudden death where autopsy fails to identify any cardiac or extracardiac underlying cause. Guideline‐directed standard genetic testing identifies a disease‐causing mutation in less than one‐third of cases of SUD. Conversely, whole exome sequencing (WES) may provide the key to solve most cases of SUD even after several years from the subject's death. Methods We report on a case of sudden unexpected death of a 37‐year‐old male, with inconclusive autopsy conducted 14 years ago. A recent reevaluation through WES was performed on DNA extracted from left ventricular samples. A multiple step process including several “in silico” tools was applied to identify potentially pathogenic variants. Data analysis was based on a 562 gene panel, including 234 candidate genes associated with sudden cardiac death or heart diseases, with the addition of 328 genes highly expressed in the heart. WebGestalt algorithms were used for association enrichment analysis of all genes with detected putative pathogenic variants. Results WES analysis identified four potentially pathogenic variants: RYR2:c.12168G>T, TTN:c.11821C>T (rs397517804), MYBPC3:c.1255C>T (rs368770848), and ACADVL:c.848T>C (rs113994167). WebGestalt algorithms indicated that their combination holds an unfavorable arrhythmic susceptibility which conceivably caused the occurrence of the events leading to our subject's sudden death. Conclusion Associating WES technique with online prediction algorithms may allow the recognition of genetic mutations potentially responsible for otherwise unexplained deaths