Retrovirális proteinázok vizsgálata a rezisztencia kialakulásának megértéséhez, és felhasználásuk biológiai folyamatok szabályozására = Study of retroviral proteinases to understand development of resistance and their use in regulation of biological processes

Számos, gyógyszerrezisztenciában megjelenő mutációt tartalmazó HIV-1 proteináz specificitását, gátolhatósági profilját és dimerstabilitását jellemeztük. A gátolhatósági profilok elkészítéséhez nagykapacitású floreszcens mérési módszert dolgoztunk ki. Eredményeink arra utaltak, hogy a mutánsok gátolhatóságát jelentősen befolyásolta a ligandok konformációs flexibilitása, továbbá az enzim egyik régiója képes volt mutációktól függetlenül a ligandhoz illeszkedni. Cefalosporin származékokat tartalmazó vegyületkönyvtár szűrésével különleges, unkompetitív mechanizmusú HIV-1 proteináz inhibitorokat azonosítottunk. A HIV-1 fertőzés korai szakaszában szubsztrátként valószínűsített nukleokapszid fehérje hasításával kapcsolatban szubsztrát-mutagenezis és kinetikai vizsgálatokat végeztünk és a mutációkat a HIV vírusba bejuttatva korrelációt tapasztaltunk a fertőzőképesség és a nukleokapszid fehérje proteolitikus érzékenysége között. Különböző retrovírusok természetes hasítási helyeit reprezentáló oligopeptidekkel összehasonlítottuk retrovirális proteinázok specificitását, mely alapján a HTLV-1 proteáz szubsztrátspecificitása meglehetősen szűknek bizonyult. Egy HIV-1 természetes hasítási helyet reprezentáló oligopeptid sorozattal végzett korábbi szubsztrátspecificitási vizsgálatainkat részben kiegészítettük úgy, hogy az adatsor már 11 retrovirális proteáz adatait tartalmazza. Egy alhely feltérképezésével kapott eredményeink jól korreláltak a retrovírusok filogenetikai analízisével. | Specificity, dimer stability and inhibition profile was determined for several HIV-1 protease mutants harboring mutations occurring in drug resistance. To perform the inhibition profiling, a new, high-throughput fluorescent assay was developed. Our results suggested that the inhibition of the mutants was stronlgy dependent on the conformational flexibility of the inhibitors, furthermore, a critical region of the enzyme was able to fit flexibly to the ligands, independently from its mutations. Screening a library of cephalosporin derivatives, inhibitors uniqally acting in an uncompetitive manner were identified. Mutational and kinetic studies were performed on the nucleocapsid protein, which is suspected to be a substrate of the viral protease in the early phase of infection, and mutations were introduced into an infectious HIV-1 clone. There was a correlation between the protease sensitivity of mutant nucleocapsid proteins and the infectivity of the clones. The specificity of various retroviral proteinases was compared using a large set of oligopeptide substrates representing naturally occurring cleavage sites of various retroviruses: the specificity of HTLV-1 protease appeared to be fairly narrow. We have complemented our previous specificity studies performed with a substrate set representing an HIV-1 cleavage site to probe a substrate binding subsite of 11 retroviral proteases. The results obtained correlated well with the philogenetic analysis of retroviruses

A retrovirális proteázok szerepének vizsgálata a retrovírusok életciklusának korai fázisában = Studies on the retroviral protease in the early phase of life-cycle

A kapsztid (CA) és nukleokapszid (NC) hasítási vizsgálatok elősegítésére számos retrovirális proteázt (PR) jellemeztük, többek között a human T-sejtes leukémia valamint a xenotróp egér leukemia vírus-rokon vírusét is. Igazoltuk a korábban azonosított HIV-1 CA hasítási helyeket, valamint egy új helyet is azonosítottunk. Számos egyszeres és többszörös mutációt hoztunk létre rekombináns, hexahisztidin farokkal expresszált CA fehérjében. A mutánsok proteolitikus érzékenysége jó egyezést mutatott a várt hatásokkal. Ugyanakkor még nyolc mutációval sem sikerült teljesen HIV-1 PR-rezisztenssé tenni a fehérjét. A vizsgált mutációkat bevittük egy harmadik generációs öninaktiválódó lentivírus rendszerbe is. Mind a proteáz érzékeny illetve hasítást gátló CA mutációkat tartalmazó vírusok fertőzőképessége csökkent. Meghatározott vagy jósolt NC fehérje hasítási helyeket tartalmazó oligopeptideket valamint rekombináns NC fehérjéket vizsgáltunk mint PR szubsztrátok. Eredményeink alapján nem csak lentivírus NC fehérjék lehetnek PR szubsztrátok. A virológiai vizsgálatok elősegítésére vizsgáltuk a HIV-1 PR specificitását NC alapú szubsztrátokkal, valamint számos „revertáns” szubsztrátok terveztünk, melyekben a cink-újj motívum belső része nem változott, a hasíthatóságot külső oldalláncok változtatása biztosította. Vizsgáltuk a celluláris protóm változását HIV-1 fertőzés során, és indukálódó fehérjéket azonosítottunk. | To facilitate the comparative capsid (CA) and nucleocapsid (NC) cleavage specificity studies, various retroviral proteases (PRs) were characterized including those of human T-cell lymthotropic and xenotropic murine leukemia virus-related viruses. We verified the previously found cleavage sites in CA of HIV-1 and identified a new one. Single and multiple cleavage site mutations were introduced into a recombinant his-tagged CA. The proteolytic susceptibility of the mutants was in good agreement with the expected changes. However, even eight mutations were not sufficient to make CA resistant towards HIV-1 PR. The studied mutations were introduced into a third generation self-inactivating HIV-1-based lentiviral system. Infectivity assays suggested, that both enhancing and proteolysis inhibitory mutations caused decrease in infectivity. We have studied oligopeptide substrates representing determined or predicted cleavage sites of retroviral nucleocapsid proteins, as well as recombinant NC forms. Cleavage data implied that cleavability of NC sequences might not be restricted to lentiviruses. To facilitate virological studies, we studied the HIV-1 PR specificity with NC-based substrates and designed “revertant” mutants in which cleavability was regained by introducing mutations into close vicinity of the zinc finger motifs. We have also studied the changes in the cellular proteome during the course of HIV-1 infection, and identified proteins with elevated expression

A harmadik szinapszis. Molekuláris kölcsönhatások az elhaló sejtek és az azokat eltávolító makrofágok, dendritikus sejtek között. = The third synapsis. Molecular interactions between dying cells and macrophages or dendritic cells.

A tudományos iskola keretében új interdiszciplináris kutatási terület megteremtésére került sor az apoptótikus sejtek és az azokat eltávolító sejtek közötti harmadi szinapszis tanulmányozására. Megállapítottuk, hogy a transzglutamináz 2 (TG2) enzim szerepet játszik az apoptotikus sejtek eltávolításában, az enzim hiányában autoimmun kórkép alakúl ki. A TG2 bejuthat a sejmagba, sejtbiokémiai hatása összefügg génkifejeződés befolyásolásával. Alzheimer kórban a TG2 résztvesz kovalensen összekötött fehérje aggregátumok létrehozásában. A TG2 védőhatást fejt ki a sejtelhalással szemben májsejtekben és szívizomsejtekben G fehérje, ill. protein diszulfid izomeráz aktivitásával. A PPAR? szerepet játszik az apoptótikus sejteket eltávolító fagocitáló képesség kialakításában fokozva fagocitózis gének kifejeződését. A PPAR?, a retinoid receptor és az LXR receptor szignál utak összekapcsolódnak a makrofágok koleszterol szintjének szabályozásában. A PPAR? aktiváció hatására a dendritikus sejekből fokozott fagocitózisra, hatékony lipid prezentációra és iNKT aktivitásra képes alpopuláció alakul. Apopto-fagocita Taqman Low Density Array-t fejleszttünkl 94 gén mennyiségi kifejeződése vizsgálatára. Az autofágiával elhaló sejtek eltávolítása szintén fagocitózissal történik, specifikus gének indukálódnak. A dendritikus sejtek kölcsönhatása apoptótikus vagy nekrotikus sejtekkel alkalmas az immunválasz finom szabályozására. | In the supported Research School a new interdisciplinary research area has been developed to study the third synapse formed between apoptotic cells and those which engolfe them. It has been established that the transglutaminase 2 (TG2) enzyme plays an important role in the clearance of apoptotic cells, the lack of this enzyme leads to autoimmune disease. TG2 can enter the nucleus and its cell biochemical effects are related to modulation of gene expression and modification of the cytoskeleton. In Alzheimer's disease TG2 participates in the formation of covalently cross-linked protein aggregates. TG2 can protect hepatocytes and cardiomyocytes against apoptosis through its G protein and protein disulphide isomerase activities. PPARγ contributes to the development of phagocytic capacity of macrophages by inducing specific phagocytic genes. The PPARγ, rretinoid and LXR receptor signal pathways are interlinked in regulating cholesterol content of cells. Activation of PPARγ in dendritic cells leads to the development of a subpopulation with increased phagocytic capacity, effective lipid presentation and iNKT activity. An apopto-phagocytic Taqman Low Density array has been developed for quantitative measuring of 94 genes in parallel. Cells dying by autophagy are removed by the same mechanism as apoptotic cells while specific phagocytic genes are induced. Dendritic cells interacting with apoptotic cells can fine tune the immune system

Design and Characterization of Macromolecular Inhibitors of Human Immundeficiency Virus 1 Protease

A doktori értekezésemben bemutatott munkáimban célul tűztük ki egy nagy áteresztőképességű és gyors mikrotiter lemez alapú fluorometriás módszer kidolgozását, mely alkalmas különböző retrovirális proteázok aktivitásának és gátlási állandóinak közvetlen összehasonlítására, illetve részben ezen módszerre alapozva, új típusú makromolekuláris HIV-1 PR inhibitorok tervezését, előállítását és tesztelését. Összefoglalásul elmondhatjuk, hogy a munkánk során kidolgozott fluorometriás módszer egy jó alternatíva lehet a hagyományos HPLC-alapú módszer mellett, mivel gyors és egyszerre nagy számú minta kezelését teszi lehetővé. Módszerünket a hagyományos HPLC-alapú módszerrel validáltuk vad típusú HIV-1 és HTLV-1 proteázok, valamint EDANS és DABCYL csoportokat hordozó új tervezésű szubsztrátok felhasználásával. Kidolgoztunk egy új eljárást a fluoreszcens donor és akceptor csoportokat egyszerre hordozó szubsztrátok mérése esetén fellépő belső szűrő hatás korrekciójára. Az új módszer segítségével összehasonlítottuk a HIV-1 és a HTLV-1 proteázok gátlási profilját néhány, már klinikai használatban lévő HIV-1 PR ellenes és néhány, a munkacsoportunk által tervezett HTLV-1 PR inhibitor felhasználásával. Módszerünket későbbiekben sikerrel alkalmaztuk más vad típusú és mutáns retrovirális proteázok esetében is (Kádas és mtsai, 2004; Fehér és mtsai, 2006; Sperka és mtsai, 2007). A továbbiakban a szubsztrátkötő helyen hidrofil, hidrofób és töltött aminosavakat hordozó mutáns HIV-1 proteázokat terveztünk és vizsgáltunk. A mutációk in silico megtervezése után elkészítettük és megtisztítottuk a fehérjéket, majd teszteltük azok in vitro és sejtkultúrás kísérletekben mutatott gátló hatását. A töltött aminosavakat hordozó mutánsaink, amelyek a HIV-1 proteáz ellen tervezett makromolekuláris inhibitorok egy új generációját képviselik, dózisfüggő, specifikus, transz domináns gátló hatást mutattak kísérleteinkben. Elsőként detektáltuk egy vad típusú retrovirális proteáz és egy transz domináns negatív mutáns heterodimerizációját NMR spektroszkópiával. Az Asp25Arg és a Gly49Glu csere egyéb retrovirális proteázokban is gátló hatást eredményezhet a vad típusú proteázzal szemben, mivel ezen aminosavcserék célpontjai a hidrolitikus aktivitáshoz elengedhetetlen katalitikus aszpartátok. ----- We have developed a high throughput microtiter plate fluorescent assay which can be a good alternative to the traditional HPLC-based protease assay, since it is faster and is able to measure several parallel samples. Our assay was validated by using the traditional method and applied to HIV-1 and HTLV-1 proteases. Several new fluorescent substrates containing EDANS/DABCYL groups were designed and tested. We have also developed an alternative method for the inner filter correction. Inhibition profiles of HIV-1 and HTLV-1 PRs were compared using various clinically used HIV-1 PR inhibitors and new HTLV-1 PR inhibitors were also designed and tested. Later, the new method has also been applied successfully for additional retroviral proteases. Furthermore, we have designed and investigated defective HIV-1 proteases which contained mutations in the active site and in the substrate binding site. After the in silico mutagenesis, we prepared and purified selected proteins for in vitro as well as in cell culture experiments to determine their inhibitory effect on wild-type HIV-1 PR. Mutants containing charged residues showed dose-dependent, specific, trans-dominant inhibitory effect in our experiments, and they represent a new generation of macromolecular inhibitors against HIV-1 PR. Heterodimerization could be detected, for the first time, between a wild-type retroviral PR and trans-dominant negative mutants by NMR spectroscopy using our novel hydrophilic constructs and our facile protein folding protocol. The Asp25Arg and the Gly49Glu mutations introduced into analogous positions of other retroviral PRs may exert a similar inhibitory effect on the corresponding wild-type PR. These residues target the catalytic aspartate, thus it may be considered a general strategy for all retroviral PRs

Amino Acid Preferences of Retroviral Proteases for Amino-Terminal Positions in a Type 1 Cleavage Site▿ ‡

The specificities of the proteases of 11 retroviruses were studied using a series of oligopeptides with amino acid substitutions in the P1, P3, and P4 positions of a naturally occurring type 1 cleavage site (Val-Ser-Gln-Asn-Tyr↓Pro-Ile-Val-Gln) in human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1). Previously, the substrate specificity of the P2 site was studied for the same representative set of retroviral proteases, which included at least one member from each of the seven genera of the family Retroviridae (P. Bagossi, T. Sperka, A. Fehér, J. Kádas, G. Zahuczky, G. Miklóssy, P. Boross, and J. Tözsér, J. Virol. 79:4213-4218, 2005). Our enzyme set comprised the proteases of HIV-1, HIV-2, equine infectious anemia virus, avian myeloblastosis virus (AMV), Mason-Pfizer monkey virus, mouse mammary tumor virus (MMTV), Moloney murine leukemia virus, human T-lymphotropic virus type 1, bovine leukemia virus, walleye dermal sarcoma virus, and human foamy virus. Molecular models were used to interpret the similarities and differences in specificity between these retroviral proteases. The results showed that the retroviral proteases had similar preferences (Phe and Tyr) for the P1 position in this sequence context, but differences were found for the P3 and P4 positions. Importantly, the sizes of the P3 and P4 residues appear to be a major contributor for specificity. The substrate specificities correlated well with the phylogenetic tree of the retroviruses. Furthermore, while the specificities of some enzymes belonging to different genera appeared to be very similar (e.g., those of AMV and MMTV), the specificities of the primate lentiviral proteases substantially differed from that observed for a nonprimate lentiviral protease