In vitro approach points to a chemotactic effect of melatonin on ram spermatozoa

Sperm orientation mechanisms, such as chemotaxis, are essential for the sperm to reach the oocyte and fertilize it. Melatonin is secreted by the cumulus cells and is also present in the follicular fluid in mammals. The presence of membrane receptors for melatonin in ram spermatozoa, and its proven involvement in the sperm functionality, may suggest a possible role in the guided movement towards the oocyte. Hence, the objective of the present work is to study the in vitro potential chemotactic action of melatonin on ram spermatozoa, analysing the influence of the season (breeding and non-breeding) and the sperm capacitation state. The first experimental approach consisted in the inclusion of melatonin in the upper layer of a swim-up selection method. During the non-breeding season, the presence of melatonin at 100 pM and 1 μM concentrations significantly increased the cell recovery rate, and induced changes in the sperm location of the MT2 melatonin receptor, compared with the standard swim-up. Moreover, the selected sperm population with 100 pM melatonin presented a higher percentage of capacitated spermatozoa. The greater recovery rate obtained with melatonin could be due to the stimulation of sperm movement in random directions, i.e., a chemokinetic effect, or due to a guided movement (chemotaxis) towards the gradient of the melatonin. To elucidate this issue, together with the study of the influence of the sperm capacitation status, we performed a second experimental approach which consisted in the use of chemotaxis chambers and an open-source software (Open-CASA) that analyses the sperm trajectories towards the hormone gradient and calculates a chemotaxis index (SL index). There was a significant difference between the SL index in the presence of 1 μM melatonin and the control without hormone. This effect was only observed in capacitated spermatozoa with cAMP-elevating agents (Cap-CK samples) obtained during the non-breeding season. These results would point to an in vitro chemotactic effect of melatonin on ram spermatozoa, although chemokinesis cannot be ruled out. Nonetheless, the inclusion of this hormone in the swim-up procedure could enhance the sperm recovery rate

Efecto del fluido folicular de distintas fases del ciclo estral de la oveja sobre la quimiotaxis en espermatozoides ovinos

El fluido folicular conforma el entorno bioquímico en el que se desarrolla el ovocito hasta su ovulación y tiene una composición variable a lo largo del ciclo estral. Se libera junto con el ovocito tras la ovulación, y se postula que podría ejercer una función quimioatrayente, guiando a los espermatozoides hacia el ovocito. Esta capacidad quimiotáctica se ha demostrado en algunas especies de mamíferos, pero hasta el momento, no en la especie ovina. Para responder a este mecanismo de quimiotaxis parece necesario que los espermatozoides estén capacitados, es decir, que hayan sufrido una serie de cambios moleculares y bioquímicos que les confieren la capacidad fecundante.Por ello, el objetivo de este trabajo fue estudiar la respuesta quimiotáctica de los espermatozoides ovinos en presencia de fluido folicular de la oveja obtenido en distintas fases del ciclo estral y valorar la influencia del estado de capacitación espermática en la respuesta.Para ello se utilizó fluido folicular ovino obtenido en las fases folicular y luteal tardía, a concentraciones de 2% y 10%. Se ensayaron sobre espermatozoides sin capacitar y capacitados in vitro en ausencia y presencia de agentes elevadores del AMPc, que disparan la capacitación en la especie ovina. Tras valorar la calidad de los espermatozoides (motilidad, viabilidad y estado de capacitación), se realizaron los ensayos de quimiotaxis utilizando cámaras IBIDI® μ-Slide Chemotaxis y el análisis mediante el software open CASA.Los resultados obtenidos demostraron que únicamente el fluido folicular de oveja obtenido en la fase luteal tardía, a ambas concentraciones ensayadas, es capaz de generar quimioatracción, pero solamente sobre los espermatozoides ovinos capacitados en presencia de elevadores del AMPc.<br /

Estudio de la quimiotaxis espermática utilizando diferentes dispositivos

La progesterona, el estradiol y la melatonina son hormonas secretadas por las células del cumulus que rodean al ovocito y, están presentes en el fluido folicular, estableciendo un gradiente de concentración desde las proximidades del ovocito hasta regiones más distales del tracto reproductor femenino. Esto podría dar lugar a una respuesta quimiotáctica, que guiaría al espermatozoide hasta el ovocito para fecundarlo. Los espermatozoides de mamíferos poseen receptores de membrana para las tres hormonas mencionadas, y las tres se han relacionado con el proceso de capacitación espermática previo a la fecundación. Se ha descrito que la progesterona actúa como quimioatrayente para espermatozoides humanos y de conejo, y que la melatonina provoca quimiotaxis en células tumorales y somáticas. Por ahora no hay estudios acerca del papel quimiotáctico de estas hormonas en espermatozoides ovinos, por lo que su estudio constituyó el objetivo principal de este trabajo. Se evaluó la respuesta quimiotáctica frente a dichas hormonas a diferentes concentraciones (100 pM y 1 μM) tanto en espermatozoides seleccionados por swim up (sin capacitar) como en espermatozoides capacitados in vitro (sin y con agentes elevadores del AMPc (cocktail)). Se utilizaron dos cámaras de estudio de quimiotaxis (Dunn e Ibidi) y, para el análisis, un software desarrollado por el grupo (OpenCASA) que proporciona un índice quimiotáctico. Los resultados obtenidos mostrarían una cierta capacidad quimiotáctica de la progesterona y la melatonina sobre espermatozoides ovinos capacitados in vitro a las dosis ensayadas, ya que el índice quimiotáctico aumentó significativamente para ambas hormonas. Sin embargo, el estradiol no mostró ninguna acción quimioatrayente. Además, los resultados sugieren que la cámara Ibidi es más apropiada que la cámara Dunn para el estudio de la quimiotaxis en espermatozoides ovinos y que sólo los espermatozoides capacitados son capaces de responder al estímulo quimiotáctico.<br /

Applying Model-Driven Web Engineering to the Testing Phase of the ADAGIO Project

The Model-Driven Engineering (MDE) has been used in recent years to promote better results in the development of Web Applications, in the field that has been called Model-Driven Web Engineering (MDWE). One of the advantages of applying MDWE is that it offers a solution to reduce the cost of the tests without affecting their quality execution. This paper presents the application of a MDWE methodology (Navigational Development Techniques, NDT) that provides support for all the phases of the lifecycle of a software project development proposing transformations between these phases, to manage the test phase of a real-world case study named ADAGIO. This project, among other goals, proposes the development of a web application whose main objective is to offer researchers the possibility of integrating and consolidating heterogeneous data sources, showing a unified vision of them, allowing to simplify the search task in different repositories as well as the relationship between the sources found.Ministerio de Economía y Competitividad TIN2016- 76956-C3-2-

Estudio de la activación del canal de calcio CatSper en espermatozoides ovinos

El calcio es un catión que actúa como agente señalizador fundamental para que los espermatozoides adquieran capacidad fecundante, dado que participa en los procesos de capacitación, hiperactivación, quimiotaxis y reacción acrosómica. El canal más importante encargado de la entrada de calcio a los espermatozoides es CatSper, un canal específico de la célula espermática localizado en la membrana de la pieza intermedia del flagelo. Para que el calcio entre al espermatozoide a través de CatSper, éste tiene que activarse. En espermatozoides humanos está descrito que CatSper se activa por: 1) despolarización de la membrana plasmática por cambios de voltaje, 2) alcalinización del medio intracelular, y 3) unión a determinados ligandos, como la progesterona. En este trabajo se planteó la hipótesis de que existen diferencias entre los mecanismos de activación del canal CatSper en espermatozoides ovinos y humanos. El objetivo de este trabajo fue, por tanto, estudiar si las formas de activación de CatSper en espermatozoides humanos producen también la activación de CatSper en espermatozoides ovinos. Además, se estudiaron los efectos de inhibidores conocidos de CatSper en humano, como ESI-09 y H-89, en espermatozoides ovinos.Para ello, se realizaron los mismos experimentos en espermatozoides de ambas especies, previamente seleccionados por swim-up. Los cambios en la concentración de calcio intracelular y en el pH intracelular se evaluaron mediante fluorimetría con las sondas Fluo-4-AM y BCECF, respectivamente. Los resultados mostraron que el H-89 no ejerce ningún efecto sobre CatSper en los espermatozoides ovinos y que, sorprendentemente, el ESI-09 favorece el incremento de [Ca2+]i en espermatozoides ovinos expuestos a altas concentraciones de calcio en el medio extracelular. De los tres mecanismos de activación de CatSper ensayados en espermatozoides ovinos, solo la activación por despolarización de la membrana plasmática en un medio con alta concentración de K+ y pH 8 produce un incremento del calcio intracelular.<br /

Estudio de la posible acción protectora de la melatonina frente al daño por frío en espermatozoides ovinos

Las dosis seminales ovinas se suelen refrigerar para su uso a corto plazo en inseminación artificial. Los espermatozoides de la especie ovina son especialmente susceptibles al frío, y su exposición a bajas temperaturas produce una serie de cambios entre los que se incluyen pérdida de motilidad, de integridad de membrana, aumento de marcadores apoptóticos y una capacitación prematura o criocapacitación. La capacitación es un proceso complejo por el cual los espermatozoides adquieren capacidad fecundante, pero si esta se produce lejos del ovocito, el espermatozoide no será capaz de cumplir su misión, por lo que una capacitación prematura consecuencia del frío resulta indeseable. La melatonina es una hormona importante en la regulación de la reproducción. El descubrimiento de la presencia de receptores para esta hormona en la superficie del espermatozoide ovino, indicaría una acción directa de la misma sobre la funcionalidad de estas células. Algunas de las rutas moleculares a través de las que actúa la melatonina en algunas células somáticas también están implicadas en la regulación de procesos fisiológicos del espermatozoide, como la capacitación. Además, también se atribuye un papel protector frente a la apoptosis en algunos tipos celulares. Por ello, en el presente trabajo se planteó la hipótesis de que la melatonina podría tener un efecto de protección frente al frío en espermatozoides, evitando los cambios relacionados con la criocapacitación y el aumento de marcadores apoptóticos. El objetivo de este estudio fue estudiar el efecto de diferentes concentraciones de melatonina añadidas a los espermatozoides antes de ser sometidos a bajas temperaturas, analizando distintos parámetros relacionados con la funcionalidad espermática: motilidad, integridad de membrana, estado de capacitación (relacionado con la distribución del calcio intracelular y la fosforilación de tirosinas de proteínas de membrana) y marcadores apoptóticos. Los resultados obtenidos indican que la refrigeración directa a 5 ºC, aunque no afecta a la motilidad espermática, produce efectos subletales sobre los espermatozoides reflejándose en una disminución importante del resto de parámetros de calidad seminal. Las dosis de melatonina utilizadas (100 pM, 10 nM y 1 μM) no mejoran de manera significativa los valores de motilidad e integridad de membrana, pero sí disminuye significativamente el porcentaje de espermatozoides capacitados si se incuba la muestra con las dosis de 100 pM y 10 nM previamente a la refrigeración. La melatonina, a dosis bajas (100 pM), disminuye el porcentaje de espermatozoides con marcadores apoptóticos como la inversión de fosfatidilserina y la actividad de caspasas, si bien este descenso no es significativo. En conclusión, en este estudio se demuestra que la melatonina es capaz de evitar, al menos parcialmente, la capacitación prematura asociada a frío

Does melatonin exert its effect on ram sperm capacitation through nitric oxide synthase regulation?

Nitric oxide (NO·), synthesized from L-arginine by nitric oxide synthase (NOS), is involved in sperm functionality. NOS isoforms have been detected in spermatozoa from different species, and an increment in NOS activity during capacitation has been reported. This work aims to determine the presence and localization of NOS isoforms in ram spermatozoa and analyse their possible changes during in vitro capacitation. Likewise, we investigated the effect of melatonin on the expression and localization of NOS and NO· levels in capacitated ram spermatozoa. Western blot analysis revealed protein bands associated with neuronal NOS (nNOS) and epithelial NOS (eNOS) but not with inducible NOS (iNOS). However, the three isoforms were detected by indirect immunofluorescence (IFI), and their immunotypes varied over in vitro capacitation with cAMP-elevating agents. NO· levels (evaluated by DAF-2-DA/PI staining) increased after in vitro capacitation, and the presence of L-arginine in the capacitating medium raised NO· production and enhanced the acrosome reaction. Incubation in capacitating conditions with a high-cAMP medium with melatonin modified the NOS distribution evaluated by IFI, but no differences in Western blotting were observed. Melatonin did not alter NO· levels in capacitating conditions, so we could infer that its role in ram sperm capacitation would not be mediated through NO· metabolism

Immune and spermatogenesis-related loci are involved in the development of extreme patterns of male infertility

Acknowledgements We thank the National DNA Bank Carlos III (University of Salamanca, Spain) for supplying part of the control DNA samples from Spain and all the participants for their essential collaboration. This work was supported by the Spanish Ministry of Science through the Spanish National Plan for Scientific and Technical Research and Innovation (refs. SAF2016-78722-R and PID2020-120157RB-I00), the Andalusian Plan for Research and Innovation (PAIDI 2020) (ref. PY20_00212), and the R+D+i Projects of the FEDER Operational Programme 2020 (ref. B-CTS-584-UGR20). F.D.C. was supported by the “Ramón y Cajal” programme (ref. RYC-2014-16458), and L.B.C. was supported by the Spanish Ministry of Economy and Competitiveness through the “Juan de la Cierva Incorporación” programme (ref. IJC2018-038026-I, funded by MCIN/AEI /10.13039/ 501100011033), all of them including FEDER funds. A.G.J. was funded by MCIN/AEI /10.13039/501100011033 and FSE “El FSE invierte en tu futuro” (ref. FPU20/02926). IPATIMUP integrates the i3S Research Unit, which is partially supported by the Portuguese Foundation for Science and Technology (FCT), financed by the European Social Funds (COMPETE-FEDER) and National Funds (projects PEstC/SAU/LA0003/2013 and POCI-01-0145-FEDER-007274). A.M.L. is funded by the Portuguese Government through FCT (IF/01262/2014). P.I.M. is supported by the FCT post-doctoral fellowship (SFRH/BPD/120777/2016), financed from the Portuguese State Budget of the Ministry for Science, Technology and High Education and from the European Social Fund, available through the Programa Operacional do Capital Humano. ToxOmics—Centre for Toxicogenomics and Human Health, Genetics, Oncology and Human Toxicology, Nova Medical School, Lisbon, is also partially supported by FCT (Projects: UID/BIM/00009/ 2013 and UIDB/UIDP/00009/2020). SLarriba received support from “Instituto de Salud Carlos III” (grant DTS18/00101], co-funded by FEDER funds/European Regional Development Fund (ERDF)—a way to build Europe), and from “Generalitat de Catalunya” (grant 2017SGR191). SLarriba is sponsored by the “Researchers Consolidation Programme” from the SNS-Departament de Salut Generalitat de Catalunya (Exp. CES09/ 020). The German cohort was recruited within the Male Reproductive Genomics (MERGE) study and supported by the German Research Foundation Clinical Research Unit ‘Male Germ Cells’ (DFG CRU326, grants to F.T. and J.G.). This article is related to the Ph.D. Doctoral Thesis of Miriam Cerván-Martín (grant ref. BES-2017-081222 funded by MCIN/AEI/10.13039/501100011033 and FSE “El FSE invierte en tu futuro”).We conducted a genome-wide association study in a large population of infertile men due to unexplained spermatogenic failure (SPGF). More than seven million genetic variants were analysed in 1,274 SPGF cases and 1,951 unaffected controls from two independent European cohorts. Two genomic regions were associated with the most severe histological pattern of SPGF, defined by Sertoli cell-only (SCO) phenotype, namely the MHC class II gene HLA-DRB1 (rs1136759, P = 1.32E-08, OR = 1.80) and an upstream locus of VRK1 (rs115054029, P = 4.24E-08, OR = 3.14), which encodes a protein kinase involved in the regulation of spermatogenesis. The SCO-associated rs1136759 allele (G) determines a serine in the position 13 of the HLA-DRβ1 molecule located in the antigen-binding pocket. Overall, our data support the notion of unexplained SPGF as a complex trait influenced by common variation in the genome, with the SCO phenotype likely representing an immune-mediated condition.Andalusian Plan for Research and InnovationJuan de la Cierva Incorporación IJC2018-038026-IMinistry for Science, Technology and High EducationBES-2017-081222, MCIN/AEI/10.13039/501100011033National Funds IF/01262/2014, PEstC/SAU/LA0003/2013, POCI-01-0145-FEDER-007274, SFRH/BPD/120777/2016PAIDI 2020 PY20_00212R+D+i Projects B-CTS-584-UGR20, RYC-2014-16458Faculty of Science and Engineering, University of Manchester FPU20/02926Deutsche Forschungsgemeinschaft DFG CRU326Fundação para a Ciência e a TecnologiaGeneralitat de Catalunya 2017SGR191Ministerio de Economía y CompetitividadInstituto de Salud Carlos III DTS18/00101Ministerio de Ciencia e InnovaciónEuropean Social Fund UIDB/UIDP/00009/2020European Regional Development FundFundació Catalana de TrasplantamentDepartament de Salut, Generalitat de Catalunya CES09/020Programa Operacional Temático Factores de CompetitividadeSpanish National Plan for Scientific and Technical Research and Innovation PID2020-120157RB-I00, SAF2016-78722-

The C-Terminal Half of SARS-CoV-2 Nucleocapsid Protein, Industrially Produced in Plants, Is Valid as Antigen in COVID-19 Serological Tests

Background: The fight against the current coronavirus disease 2019 (COVID-19) pandemic has created a huge demand of biotechnological, pharmaceutical, research and sanitary materials at unprecedented scales. One of the most urgent demands affects the diagnostic tests. The growing need for rapid and accurate laboratory diagnostic tests requires the development of biotechnological processes aimed at producing reagents able to cope with this demand in a scalable, cost-effective manner, with rapid turnaround times. This is particularly applicable to the antigens employed in serological tests. Recombinant protein expression using plants as biofactories is particularly suitable for mass production of protein antigens useful in serological diagnosis, with a neat advantage in economic terms. Methods: We expressed a large portion of the nucleoprotein (N) derived from SARS-CoV-2 in Nicotiana benthamiana plants. After purification, the recombinant N protein obtained was used to develop an indirect enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for detection of antibodies to SARS-CoV-2 in human sera. To validate the ELISA, a panel of 416 sera from exposed personnel at essential services in Madrid City Council were tested, and the results compared to those obtained by another ELISA, already validated, used as reference. Furthermore, a subset of samples for which RT-PCR results were available were used to confirm sensitivity and specificity of the test. Results: The performance of the N protein expressed in plants as antigen in serologic test for SARS-CoV-2 antibody detection was shown to be highly satisfactory, with calculated diagnostic sensitivity of 96.41% (95% CI: 93.05-98.44) and diagnostic specificity of 96.37 (95% CI: 93.05-98.44) as compared to the reference ELISA, with a kappa (K) value of 0.928 (95% CI:0.892-0.964). Furthermore, the ELISA developed with plant-derived N antigen detected SARS-CoV-2 antibodies in 84 out of 93 sera from individuals showing RT-PCR positive results (86/93 for the reference ELISA). Conclusion: This study demonstrates that the N protein part derived from SARS-CoV-2 expressed in plants performs as a perfectly valid antigen for use in COVID-19 diagnosis. Furthermore, our results support the use of this plant platform for expression of recombinant proteins as reagents for COVID-19 diagnosis. This platform stands out as a convenient and advantageous production system, fit-for-purpose to cope with the current demand of this type of biologicals in a cost-effective manner, making diagnostic kits more affordable.Work at Agrenvec and at the CBGP was funded in part by grant COV20-00114 from the Autonomous Region of Madrid (CAM) to FP. The CBGP thanks the Spanish Ministry of Science for the Severo Ochoa Excellence Accreditation (SEV-2016-0672).S

Factores relacionados con la adherencia al tratamiento antirretroviral en mujeres con VIH: Un estudio mixto con diseño secuencial

Background: HIV/AIDS is affecting more and more women. Adherence to antiretroviral treatment (ART) is decisive for those infected to achieve quality of life. Purpose: The aim of the present study is to determine the degree of adherence displayed by a group of women with HIV/AIDS and to identify those factors and circumstances which might influence their adherence to ART. Method: A sequential mixed model research design was applied. The subjects studied consisted of 86 women diagnosed with HIV/AIDS and treated with ART. Findings and discussion: Qualitative data were collected from 18 of these women. 59.3% of participants were non-adherents. The determining factors for non-adherence were level of education, age, income, as well as personal and/or interpersonal factors such as socio-familial support, perceived stigma, self-stigma and factors related to disease and treatment. Nursing care should take a gender-focused approach towards those psychological and personal factors inherent in the adherence process.Introducción: El VIH/Sida afecta cada vez a más mujeres. La adherencia al tratamiento antirretroviral es decisiva en la calidad de vida de las personas infectadas. Objetivos: El objetivo del estudio es determinar el grado de adherencia manifestada en un grupo de mujeres con VIH/Sida, con TAR e identificar los factores y circunstancias que influyen en su adherencia.Metodología: Se ha realizado un estudio con diseño mixto secuencial explicativo. Los sujetos de estudio son 86 mujeres diagnosticadas con VIH/Sida en tratamiento con TARGA. Resultados: Se recogieron datos cualitativos de 18 de ellas. El 59,3% de las participantes son no adherentes. Los factores determinantes de la no adherencia son el grado académico, edad, ingresos, así como factores personales, interpersonales como el apoyo sociofamiliar, estigma percibido y autoestigma y factores relativos a la enfermedad y tratamiento. Conclusión: Los cuidados de enfermería deben abordar con enfoque de género aquellos factores psicosociales e individuales del proceso de adherencia