A conserved target site in HIV-1 Gag RNA is accessible to inhibition by both an HDV ribozyme and a short hairpin RNA

Abstract: Antisense-based molecules targeting HIV-1 RNA have the potential to be used as part of gene or drug therapy to treat HIV-1 infection. In this study, HIV-1 RNA was screened to identify more conserved and accessible target sites for ribozymes based on the hepatitis delta virus motif. Using a quantitative screen for effects on HIV-1 production, we identified a ribozyme targeting a highly conserved site in the Gag coding sequence with improved inhibitory potential compared to our previously described candidates targeting the overlapping Tat/Rev coding sequence. We also demonstrate that this target site is highly accessible to short hairpin directed RNA interference, suggesting that it may be available for the binding of antisense RNAs with different modes of action. We provide evidence that this target site is structurally conserved in diverse viral strains and that it is sufficiently different from the human transcriptome to limit off-target effects from antisense therapies. We also show that the modified hepatitis delta virus ribozyme is more sensitive to a mismatch in its target site compared to the short hairpin RNA. Overall, our results validate the potential of a new target site in HIV-1 RNA to be used for the development of antisense therapies

Investigating a New Generation of Ribozymes in Order to Target HCV

For a long time nucleic acid-based approaches directed towards controlling the propagation of Hepatitis C Virus (HCV) have been considered to possess high potential. Towards this end, ribozymes (i.e. RNA enzymes) that specifically recognize and subsequently catalyze the cleavage of their RNA substrate present an attractive molecular tool. Here, the unique properties of a new generation of ribozymes are taken advantage of in order to develop an efficient and durable ribozyme-based technology with which to target HCV (+) RNA strands. These ribozymes resulted from the coupling of a specific on/off adaptor (SOFA) to the ribozyme domain derived from the Hepatitis Delta Virus (HDV). The former switches cleavage activity “on” solely in the presence of the desired RNA substrate, while the latter was the first catalytic RNA reported to function naturally in human cells, specifically in hepatocytes. In order to maximize the chances for success, a step-by-step approach was used for both the design and the selection of the ribozymes. This approach included the use of both bioinformatics and biochemical methods for the identification of the sites possessing the greatest potential for targeting, and the subsequent in vitro testing of the cleavage activities of the corresponding SOFA-HDV ribozymes. These efforts led to a significant improvement in the ribozymes' designs. The ability of the resulting SOFA-HDV ribozymes to inhibit HCV replication was further examined using a luciferase-based replicon. Although some of the ribozymes exhibited high levels of cleavage activity in vitro, none appears to be a potential long term inhibitor in cellulo. Analysis of recent discoveries in the cellular biology of HCV might explain this failure, as well as provide some ideas on the potential limits of using nucleic acid-based drugs to control the propagation of HCV. Finally, the above conclusions received support from experiments performed using a collection of SOFA-HDV ribozymes directed against HCV (−) strands

Étude du ribozyme SOFA-HDV comme outil moléculaire : application et optimisation

Les avancées en biologie moléculaire et cellulaire des dernières décennies ont permis de redéfinir le rôle de l’ARN au sein des cellules de tous les domaines du vivant. Initialement cantonné dans un rôle de support transitoire de l’information génétique du génome (ADN) en direction des effecteurs ou molécules actives (protéines et métabolites), l’ARN est maintenant associé à toutes les sphères de la biologie. Les molécules d’ARN peuvent agir autant comme génome (virus), comme molécules adaptatrices (ARNt), comme messager de l’information génétique (ARNm), comme enzyme (ribozyme) ou encore comme molécules régulatrices en cis (riboswitch) ou en trans (miARN). Nous savons aussi que la grande majorité du génome des cellules eucaryotes est transcrite à un moment ou un autre. Ces implications de l’ARN en font une cible de choix pour la recherche en génomique fonctionnelle, ainsi que pour des applications thérapeutiques. C’est pourquoi, depuis la découverte des ARN catalytiques et de l’interférence à l’ARN, beaucoup d’efforts ont été consacrés pour développer un éventail d’outils moléculaires permettant d’inhiber l’expression de gènes d’intérêt. Le défi qui se dessine aujourd’hui est le développement d’outils plus spécifiques et plus efficaces, entre autres parce que la variété d’ARN qu’un inhibiteur peut rencontrer est beaucoup plus grande qu’initialement estimée. De plus, les données recueillies lors d’essais cliniques montrent la nécessité de combiner un très grand potentiel avec une spécificité accrue. Les travaux de cette thèse se concentrent sur un outil moléculaire qui a le potentiel de répondre positivement à ce défi : le ribozyme SOFA-HDV. Mon projet de recherche visait à démontrer le potentiel de cet ARN catalytique pour le ciblage de gènes in cellulo et de développer son application. Tout d’abord, j’ai démontré que le ribozyme SOFA-HDV pouvait être utilisé pour inhiber la fonction d’un ARN in cellulo. Cette étude a également mis en évidence l’usage de ce ribozyme comme agent antiviral, avec le virus de l’hépatite C comme modèle. Le développement de nouvelles thérapies plus performantes avec peu d’effets secondaires demeure un enjeu important. Au moment de publier ces travaux, en plus d’être le premier exemple exhaustif de l’utilisation du ribozyme SOFA-HDV in cellulo, notre étude contenait le plus grand nombre de ribozymes jamais testés contre le VHC en une seule publication. Bien que modeste, l’effet observé démontre que ce ribozyme peut inhiber la réplication d’un virus dans un modèle in cellulo. Nos résultats exposent aussi la différence d’accessibilité entre les ARN de polarités positive et négative du VHC in cellulo. Par la suite, j’ai participé au développement de ribozymes SOFA-HDV ciblant le virus de l'immunodéficience humaine (VIH) dans le cadre d’une collaboration. Parmi les ribozymes testés, nous en avons identifié un dont l’activité catalytique réduit la réplication du VIH de plus de 50 % dans un modèle cellulaire. Dans le cadre de cette étude, nous avons identifié un site hautement favorable pour le ciblage par un ribozyme SOFA-HDV ou par un shARN. Des données suggèrent aussi une spécificité élevée du ribozyme SOFA-HDV. Des tests d’inhibition avec différentes souches du VIH montrent que l’activité du ribozyme est affectée avec un seul mésappariement entre le biosenseur (élément du module SOFA resposable de reconnaissance du substrat) et son site de liaison. Finalement, dans un esprit d’intégration des connaissances recueillies au fil des différents projets impliquant le ribozyme SOFA-HDV, je me suis intéressé à leur processus de sélection pour le ciblage génique. J’ai démontré l’impact de la séquence du biosenseur sur l’activité du ribozyme. J’ai également illustré l’autocoupure possible lorsque la séquence du biosenseur crée un prolongement du bloqueur (élément du module SOFA agissant comme verrou) ainsi que l’impact de la structure du substrat autant au niveau des sites de liaison du domaine de reconnaissance que du biosenseur. Ces nouveaux éléments combinés aux données antérieures sur le ribozyme HDV original m’ont permis d’élaborer une marche à suivre pour la présélection des ribozymes SOFA-HDV selon leur potentiel comme ciseaux moléculaires. En conclusion, ces travaux ont contribué à mettre de l’avant le potentiel du ribozyme SOFA-HDV pour des applications de ciblage de gènes, plus particulièrement pour des cibles virales. De ce fait, il existe maintenant des exemples concrets de l’utilisation de ce ribozyme en cellules humaines. Tout indique que la spécificité du module SOFA est préservée in cellulo et serait avantageusement comparable à d’autres technologies. Globalement, cette thèse devrait rendre l’utilisation du ribozyme SOFA-HDV plus accessible et favoriser son développement comme outil moléculaire