Hematotoxicity of bacillus thuringiensis as spore-crystal strains cry1aa, cry1ab, cry1ac or cry2aa in swiss albino mice

Formulated and sporulated cultures of Bacillus thuringiensis (Bt) have been widely used against insect pests, but after the advent of genetically modified plants expressing δ-endotoxins, the bioavailability of Cry proteins has been increased. For biosafety reasons their adverse effects should be studied, mainly for non-target organisms. Thus, we evaluated, in Swiss albino mice, the hematotoxicity and genotoxicity of four Bt spore-crystals genetically modified to express individually Cry1Aa, Cry1Ab, Cry1Ac or Cry2A, administered alone by gavage with a single dose of 27 mg/ Kg, 136 mg/Kg or 270 mg/Kg, 24 h, 72 h or 7 days before euthanasia. Binary combinations of these four spore-crystal proteins were also assayed at 270 mg/Kg with a single administration 24 h before euthanasia. Control mice received filtered water or cyclophosphamide at 27 mg/kg. For hematotoxicity evaluations, blood samples were drawn by cardiac puncture and processed in a multiple automated hematology analyzer; for genotoxicity analyses, micronucleus test was carried out in mice bone marrow cells. Spore-crystal administrations provoked selective hematotoxicity for the 3 exposure times, particularly for erythroid lineage. A significant reduction in bone marrow cell proliferation demonstrated cytotoxic but not genotoxic effects. These effects persisted for all exposure times, becoming more evident at 7 days. Similar results were observed for binary combinations at 24 h, suggesting that further studies are required to clarify the mechanism involved in the hematotoxicity found in mice, and to establish the toxicological risks to non-target organisms, especially mammals, before concluding that these microbiological control agents are safe for mammals

Avaliação da hematotoxicidade e da genotoxicidade de diferentes esporos-cristais do Bacillus thuringiensis em camundongos Swiss

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, 2010.As proteínas inseticidas (ICPs) do Bacillus thuringiensis (Bt) são δ-endotoxinas produzidas sob a forma das inclusões cristalinas geométricas durante a esporulação e designadas como proteínas cristais (Cry). As toxinas Bt conferem a este entomopatógeno propriedades inseticidas, sendo usadas em várias formulações de bioinseticidas rotineiramente empregadas no controle biológico de pragas agrícolas. Inseticidas Bt têm a vantagem de serem muito mais específicos do que os inseticidas químicos sintéticos de amplo espectro, e, portanto, são considerados como agentes de controle de insetos favoráveis ao meio ambiente. Entretanto, com a introdução no ambiente das plantas geneticamente modificadas que expressam as δ-endotoxinas (plantas transgênicas de colheitas), a disponibilidade biológica das proteínas Cry aumentou, e por questões de biossegurança seus efeitos devem ser rigorosamente investigados, sobretudo, para organismos não-alvo. As avaliações de plantas-Bt devem considerar tanto o seu potencial para produzir efeitos perigosos quanto a exposição de organismos sensíveis e não-alvo resultante da disseminação e persistência da toxina. Assim, objetivou-se avaliar, em camundongos albinos Swiss, a hematotoxicidade e genotoxicidade de quatro variedades de Bt esporos-cristais cry1Aa, Cry1Ab, Cry1Ac e Cry2Aa, administrados em uma única dose oral (por gavagem) ou intraperitoneal de 27 mg/Kg (dose mínima), 136 mg/Kg (dose intermediária) ou 270 (dose máxima) mg/Kg, 24 h antes da eutanásia. Para a via oral, os efeitos de cada um dos esporos-cristais também foram testados após uma única administração de 72 h ou 7 dias antes da eutanásia; combinações binárias de Cry foram avaliadas na dose máxima, com uma única administração 24 h antes da eutanásia. Camundongos controle receberam água filtrada (controle negativo) ou ciclofosfamida (CP - controle positivo) a 27 mg/Kg. Para as avaliações de hematotoxicidade, amostras de sangue coletadas por punção cardíaca foram processadas em um analisador hematológico automatizado; para as análises de genotoxicidade, o teste do micronúcleo foi realizado em células da medula óssea dos camundongos. Os efeitos hematotóxicos e/ou genotóxicos variaram com a dose, o esporo-cristal estudado e a via de administração. Cry1Ac 136 mg/kg administrada intraperitonealmente foi a mais tóxica, provocando 100% de mortalidade nos camundongos, enquanto alterações hematológicas e da medula óssea ocorreram em função dos demais tratamentos em ambas as vias. Na via oral, as administrações com Cry provocaram hematototoxicidade seletiva para os 3 tempos de exposição, sendo particularmente tóxicas para a linhagem eritróide; leucocitose também foi observada, bem como redução significativa da proliferação de células da medula óssea, demonstrando efeitos citotóxicos, mas não genotóxicos. Tais efeitos persistiram nos outros tempos de exposição, tornando-se mais evidentes no tempo de 7 dias. Os mesmos tipos de resultados foram observados para as combinações binárias no tempo de exposição de 24 h. Assim, os resultados indicam que (1) as toxinas Cry não foram destruídas no estômago; (2) possivelmente, foram ativadas no intestino, e (3) persistiram no corpo dos animais. Também sugerem a possibilidade da existência de moléculas Cry-receptoras desconhecidas no intestino de vertebrados, ou pelo menos de receptores com alguma afinidade pelas toxinas Cry. A via intraperitoneal foi mais tóxica do que via oral, apresentando alterações leucocitárias mais graves, bem como citotoxicidade para a medula óssea e genotoxicidade. Assim, os resultados demonstraram que as toxinas Cry não são inócuas para vertebrados e que a disseminação e a persistência das toxinas Bt no ambiente em função do aumento das culturas transgênicas pode ter efeitos ecológicos e para a saúde perigosos. Além disso, levando-se em consideração a exposição contínua de humanos e animais (particularmente os domésticos) em níveis consideráveis de Bt através da dieta, os resultados sugerem que são necessários protocolos mais eficientes de avaliação, com exposição mais longa dos mamíferos a estas dietas, e envolvendo observações clínicas antes de concluir que os transgênicos Bt são seguros para a alimentação

Toxicological Evaluation of a Potential Immunosensitizer for Use as a Mucosal Adjuvant—Bacillus thuringiensis Cry1Ac Spore-Crystals: A Possible Inverse Agonist that Deserves Further Investigation

In addition to their applicability as biopesticides, Bacillus thuringiensis (Bt) Cry1Ac spore-crystals are being researched in the immunology field for their potential as adjuvants in mucosal and parenteral immunizations. We aimed to investigate the hematotoxicity and genotoxicity of Bt spore-crystals genetically modified to express Cry1Ac individually, administered orally (p.o.) or with a single intraperitoneal (i.p.) injection 24 h before euthanasia, to simulate the routes of mucosal and parenteral immunizations in Swiss mice. Blood samples were used to perform hemogram, and bone marrow was used for the micronucleus test. Cry1Ac presented cytotoxic effects on erythroid lineage in both routes, being more severe in the i.p. route, which also showed genotoxic effects. The greater severity noted in this route, mainly at 6.75 mg/kg, as well as the intermediate effects at 13.5 mg/kg, and the very low hematotoxicity at 27 mg/kg, suggested a possible inverse agonism. The higher immunogenicity for the p.o. route, particularly at 27 mg/kg, suggested that at this dose, Cry 1Ac could potentially be used as a mucosal adjuvant (but not in parenteral immunizations, due to the genotoxic effects observed). This potential should be investigated further, including making an evaluation of the proposed inverse agonism and carrying out cytokine profiling