Circadian ritmusos biológiai folyamatok mechanizmusának vizsgálata madár tobozmirigy modellen. = Mechanisms of circadian rhythmic biological processes - studies on avian pineal gland.

Kimutattuk, hogy a csirke tobozmirigyben a filogenetikailag ismertebb óragének többsége, a Clock, Bmal1, Bmal2, Per1, Per2, Per3, Cry1 és Cry2 expresszálódik. A Cry1, Cry2, Bmal2 és a Clock óragének mRNS-eit sikerült kimutatni 15 napos csirke embriók tobozmirigyeiből is, valamint a kikelt állatokban mért mRNS ritmushoz fázisban hasonló mintázatot mértünk 18 napos csirke embriókban is. Az óragének expressziós mintázatát mind az éjszaka alkalmazott megvilágítás, mind az in vitro alkalmazott PACAP kezelés megváltoztatta. Kimutattuk, hogy a MT és cAMP koncentrációjának napszakos ritmusa a 16-18. embrionális napokon jelenik meg in vitro körülmények között is. A ritmikus szekréció kialakulása azonban periodikus ingerek nélkül késik. Igazoltuk, hogy bár a tobozmirigy fény-receptorai már a 14. embrionális napon is működőképesek, a fényingernek még nincs direkt, in vitro a corpus pinealéra gyakorolt szinkronizáló hatása. Ugyanakkor a 18. embrionális naptól kezdve a csirke tobozmirigy már a rendkívül alacsony intenzitású (10 lux) megvilágítással is vezérelhető. Eredményeink szerint mind a PACAP, mind a VIP már a 13. embrionális napon fokozza a cAMP és a melatonin termelést, de a ritmus fejlődését, illetve annak fázisát nem változtatja meg. Kimutattuk, hogy a tobozmirigy in vitro MT szekrécióját a környezeti hőmérséklet periodikusan alkalmazott, mindössze három órás megváltoztatása is módosítja, a hőmérséklet változására adott válasz azonban az állat életkorának függvénye. | We have demonstrated that most of the known, philogenetically conserved clock genes (Clock, Bmal1, Bmal2, Per1, Per2, Per3, Cry1 and Cry2) are expressed in the chicken pineal gland. Expression of Cry1, Cry2, Bmal2 and Clock mRNA-s were shown also in the pineal glands of chicken embryos. Similar 24-h pattern of clock gene expression were detected in 18 day old chicken embryos and in post hatched chickens (6 weeks old). The expression patterns of clock genes were altered by light exposure at subjective night and also by in vitro PACAP administration. It was shown, that the circadian rhythm of both MT secretion and cAMP efflux appears on the 16-18th embryonic days, even in vitro. Without periodic environmental stimuli, the development of the MT rhythm was delayed. Although the light receptors of the pineal gland were found to be responsive to light from the 14th embryonic day, the illumination did not have a synchronizing effect on the in vitro MT secretion at this age. However, from the 18th day, the pineal MT secretion could be controlled by illumination with even the very low intensity (10 lux). Our results showed that both PACAP and VIP induced an increase in both cAMP and MT secretion already from the 13th day of embryonic life, but none of these drugs influenced the development or the phase of the MT rhythm. It was presented that the in vitro MT secretion could be modified age-dependently by only 3 hour-long daily alterations of environmental temperature

Az óragének és a környezeti fényviszonyok szerepe az N-acetiltranszferáz génexpressziójának szabályozásában csirke retinában = The role of clock-genes and environmental lighting conditions in the regulation of N-acetyltransferase gene expression in the chicken retina

Csirke retina és tobozmirigy sejtekben a melatonin (MT) szintézis kulcsenzimének, az arilalkilamin N-acetiltranszferáznak génje (cAanat) co-expresszálódik az óragénekkel. Emellett a dopamin (DA) a fő katekolamin a retinában, mely neuroregulatorként hat. Tanulmányoztuk: 1. a cBmal1 és cAanat mRNS expressziók dinamikáját retinális/pineális sejtekben in vivo és in vitro RT-PCR-ral. A cBmal1 mRNS csúcsa a fényes fázisban volt Zeitgeber idő (ZT) 8 és 10 között, megelőzve az a cAanat expresszió éjszakai emelkedését ZT 16-17-nál. A retinális/pineális cBmal1 és cAanat mRNS ritmusainak fázisai arra utalnak, hogy kapcsolat van az expressziók között; 2. locked nucleinsav tartalmú cBmal1 antisense oligonukleotidok (AON) hatását a cAanat transzkriptumokra és az MT termelésre pinealocita kultúrában, melyet szuperfúziós rendszerben transzfektáltunk. Az AON, mely vagy az RNáz H-t aktiválta, vagy a transzlációs masinériához való kötődést blokkolta szignifikánsan csökkentette a cAanat transzkripcióját és az MT szekrécióját jelezvén a cBmal1 kulcsszerepét az indol metabolizmus szabályozásában; 3. két fő DA-receptor család (D1 és D2) szerepét a circadián retinális MT ritmus szabályozásában eye-cup modellen. A D2 agonista Quinpirol szignifikánsan csökkentette az MT szekrécióját sötét fázisban, míg a D1 agonista SKF hatástalan volt, amely arra utal, hogy a DA gátló hatást fejt ki a retinális MT szekrécióra (reciprok negativ feed-back), melyet elsősorban a D2 receptorok mediálnak. | In chicken retinal and pineal cells gene of arylalkylamine N-acetyltransferase (cAanat), the key enzyme of melatonin (MT) synthesis is co-expressed with clock genes. In addition, dopamine (DA) is the major catecholamine in the retina serving as a neuroregulator. We studied: 1. the temporal profile of cBmal1 and cAanat mRNA expressions in retinal/pineal cells in vivo and in vitro using RT-PCR. cBmal1 mRNA had a peak in the light phase between Zeitgeber time (ZT) 8 and 10, preceding the nocturnal increase in cAanat expression at ZT 16 to 17. The phase of the rhythms of retinal/pineal cBmal1 and cAanat mRNAs suggests a link between their expressions; 2. the effect of cBmal1 antisense oligonucleotides (AONs) containing locked nucleic acid on cAanat transcripts and MT production in cultured pinealocytes transfected in superfusion system. These AONs synthesized for activating RNase H or blocking the binding of the translation machinery were able to reduce significantly cAanat transcription and MT secretion indicating the key role of cBmal1 in the regulation of indole metabolism; 3. the role of the two major DA-receptor families (D1 and D2) in the regulation of circadian retinal MT rhythm on an eye-cup model. Quinpirole (D2 agonist) reduced significantly MT secretion in dark phase, whereas SKF (D1 agonist) was ineffective suggesting that DA exerts an inhibitory effect on retinal MT secretion (reciprocal negative feed-back), which is mediated primarily via D2 receptors