Human stem cell decorated nanocellulose threads for biomedical applications

Abstract Upon surgery, local inflammatory reactions and postoperative infections cause complications, morbidity, and mortality. Delivery of human adipose mesenchymal stem cells (hASC) into the wounds is an efficient and safe means to reduce inflammation and promote wound healing. However, administration of stem cells by injection often results in low cell retention, and the cells deposit in other organs, reducing the efficiency of the therapy. Thus, it is essential to improve cell delivery to the target area using carriers to which the cells have a high affinity. Moreover, the application of hASC in surgery has typically relied on animal-origin components, which may induce immune reactions or even transmit infections due to pathogens. To solve these issues, we first show that native cellulose nanofibers (nanofibrillated cellulose, NFC) extracted from plants allow preparation of glutaraldehyde cross-linked threads (NFC-X) with high mechanical strength even under the wet cell culture or surgery conditions, characteristically challenging for cellulosic materials. Secondly, using a xenogeneic free protocol for isolation and maintenance of hASC, we demonstrate that cells adhere, migrate and proliferate on the NFC-X, even without surface modifiers. Cross-linked threads were not found to induce toxicity on the cells and, importantly, hASC attached on NFC-X maintained their undifferentiated state and preserved their bioactivity. After intradermal suturing with the hASC decorated NFC-X threads in an ex vivo experiment, cells remained attached to the multifilament sutures without displaying morphological changes or reducing their metabolic activity. Finally, as NFC-X optionally allows facile surface tailoring if needed, we anticipate that stem-cell-decorated NFC-X opens a versatile generic platform as a surgical bionanomaterial for fighting postoperative inflammation and chronic wound healing problems.Peer reviewe

Nanoselluloosa-tutkimuksia: toiminnallisia mikrohiukkasia, lankoja ja aerogeelejä selluloosa-nanofibrilleistä

Nanocellulose is a general term referring to a promising new family of cellulose-based materials with attractive properties, including high mechanical strength in the dry state and the capability of forming stiff, strongly shear-thinning gels in water. Since cellulose-rich biomass is sustainably available in very large quantities, nanocellulose could potentially, e.g., replace oil-based polymers in many applications. In most current applications, nanocellulose is used as an addidive or a minor component. This thesis aims to broaden the application spectrum of nanofibrillated cellulose (NFC) to functional materials where NFC is the major constituent. This thesis consists of three publications. In Publication I, the NFC is surface modified to pre-pare non-wetting coatings comprising hydrophobized microparticles of NFC. It is observed that at many length scales, the morphology of such surfaces with the microparticles remarkably resembles that of a lotus leaf, which is famous of its superhydrophobicity and self-cleaning properties. The prepared surfaces were superhydrophobic, and water drops easily slid off when the surface was tilted slightly. In Publication II, the NFC is crosslinked to improve the mechanical strength of NFC threads in wet conditions and enable the use of NFC as a stem cell culture substrate in biomedical applications. The wetstate mechanical performance of NFC is greatly improved by crosslinking with glutaraldehyde. The crosslinked NFC threads (NFC-X) soaked in water retain up to 40% of the dry-state tensile strength of NFC. Whereas non-modified NFC is too weak to be handled after 7 days under cell culture conditions, the cross-linked NFC-X is much stronger, and can be pulled through skin and manipulated in the surgical hands-on tests performed. Furthermore, NFC-X threads are able to support stem cell growth without altering the characteristics of the cells or inducing toxicity to them. In Publication III, the rheological properties of highly concentrated NFC hydrogels are utilized to control the size of ice crystals when preparing aerogels. The stiffness of nanocellulose hydrogels can be tuned over several orders of magnitude by changing the solid contents of the gel, up to a shear modulus larger than 600 kPa. The mechanical properties of the hydrogel, in turn, enable the control over the micropore size when preparing aerogels by freeze-drying. The increase in density results in a porous material with a very high surface area to volume ratio up to 3 m2/cm and pore size down to a few micrometers. In conclusion, the results of this thesis demonstrate potential solutions to challenges in employing nanocellulose in applications outside the laboratory. The results suggest that nanocellulose may in future be employed in coatings, biomedical applications, or as functional microporous supports with a very high active surface area.Nanoselluloosalla tarkoitetaan joukkoa lupaavia uusia selluloosapohjaisia materiaaleja. Niillä on monia kiinnostavia ominaisuuksia, kuten suuri mekaaninen kuivalujuus ja kyky muodostaa vedessä jäykkiä, voimakkaasti leikkausohenevia geelejä. Koska runsaasti selluloosaa sisältävää biomassaa on kestävästi saatavilla hyvin suuria määriä, nanoselluloosa voi tulevaisuudessa korvata öljypohjaisia polymeerejä monissa sovelluksissa. Useimmissa nykysovelluksissa nanoselluloosaa käytetään lisäaineena tai pienenä osana seosta. Tämä väitöskirja koostuu kolmesta julkaisusta, joiden tavoitteena on laajentaa nanofibrilloidun selluloosan (NFC) sovellusvalikoimaa sellaisiin toiminnallisiin materiaaleihin, joissa NFC on pääasiallinen ainesosa. Julkaisussa I muokattiin NFC:n pintaa kemiallisesti, valmistettiin NFC:stä vettä hylkiviä mikro-hiukkasia ja tehtiin hiukkaisista kastumisen estäviä pinnoitteita. Tutkimuksessa havaittiin, että tällaisten mikrohiukkaspinnoitteiden pinnanmuoto muistuttaa huomattavan paljon lootuskasvin lehden pintaa, joka on tunnettu malliesimerkki superhydrofobisuudesta ja itsepuhdistuvuudesta. NFC:stä valmistetut pinnat olivat superhydrofobisia, ja vesipisarat liukuvat pois pinnalta sitä vain hieman kallistettaessa. Julkaisussa II NFC:tä ristisilloitettiin märkälujuuden parantamiseksi, jotta sitä voitaisiin käyttää kantasolujen kasvatusalustana lääketieteen tekniikan sovelluksissa. Glutaral-dehydiristisilloituksen havaittiin parantavan märän NFC:n mekaanista kestävyyttä huomattavasti: ristisilloitetut NFC-langat (NFC-X) säilyttävät vedessä liottamisen jälkeen jopa 40 % kuivan NFC:n vetolujuudesta. Oltuaan seitsemän päivää solukasvatusolosuhteissa muokkaamaton NFC on liian heikkoa käsiteltäväksi, kun taas NFC-X on niin vahvaa, että se voidaan esimerkiksi vetää ihon läpi kirurgisissa käytännön kokeissa. NFC-X ei ole myrkyllistä kantasoluille, eikä kantasolujen kasvattaminen NFC-X–lankojen pinnalla aiheuta muutoksia solujen ominaispiirteissä. Julkaisussa III säädeltiin jääkiteiden kokoa aerogeelin valmistuksen aikana korkean konsentraation NFC-hydrogeelien reologisten ominaisuuksien avulla. Havaittiin, että NFC-geelin kiintoainepitoisuutta muuttamalla voi geelin jäykkyyttä säätää useamman kertaluokan alueella, yli 600 kPa:iin asti. Hydrogeelin ominaisuudet puolestaan vaikuttavat pakastekuivaamalla valmistettujen aerogeelien huokosten kokoon. Aerogeelien verrattain suuresta tiheydestä seuraa, että pinta-alan ja tiheyden suhde on erittäin suuri, jopa 3 m2/cm, ja että materiaalin huokosten koko on vain joitain mikrometrejä. Tämä väitöskirja esittää mahdollisia ratkaisuja erilaisiin haasteisiin, joita on ollut nanoselluloosan soveltamisessa käytäntöön. Tulosten perusteella nanoselluloosaa voidaan tulevaisuudessa käyttää esimerkiksi pinnoitteissa, lääketieteen tekniikan sovelluksissa tai toiminnallisena mikrohuokoisena alustana, jolla on erittäin suuri aktiivinen pinta-ala

Nanokuituselluloosaa sisältävät biologisia materiaaleja jäljittelevät kuiturakenteet ja komposiittimateriaalit

Learning from material and structural design principles found in biological materials, it may be possible to manufacture strong and lightweight structures difficult to obtain via traditional fabrication. Biological models for such new materials include nacre and a glass sponge skeleton. The organized layered structure in nacre results in an at least hundredfold increase in toughness compared to its main constituent, the brittle mineral aragonite. The nacre structure effectively spreads stresses and damage to a wider area around a crack propagating in the material. Thus, breaking of nacre requires a large amount of energy. In the glass sponge skeleton, a biological composite material is combined with optimized structural design. The grid structure of the glass sponge appears to provide optimum mechanical performance with minimal material use. Another promising new material from a biological source is nanofibrillated cellulose. The strength of the cellulose nanofibers, together with the abundance of wood-based cellulose, makes cellulose nanofibers a promising component in novel materials. In this work, two approaches for fabricating strong and lightweight materials were explored, finding inspiration for design from biological systems and utilizing the strong natural material, nanofibrillated cellulose. First, a concept was developed to fabricate glass-sponge-mimicking structures with macroscopic fiber grids of nanofibrillated cellulose. Employing a 3D printer and principles of additive manufacturing, programmable fabrication of the grid structures was demonstrated. The macroscopic fibers prepared from nanofibrillated cellulose were found to be strong, having a tensile strength of 300 MPa. Compared to previous art, more than two times larger ultimate elongation was achieved, making the fibers remarkably tougher. Furthermore, chemically cross-linking the nanocellulose within the macroscopic fibers improved the material performance in wet environment, potentially enabling biomedical applications. 3D-printed ultra-lightweight grid structures were found to be considerably stronger in tension than in compression. Still, some of the potential strength of individual fibers was lost during the fabrication of grid structures due to defects. Further optimizing the fabrication process of the fibrous patterns, very strong and lightweight structures may be obtained. Second, a nacre-mimicking clay/polymer composite material was employed in combination with cellulose nanofibers in preparation of aerogels, i.e., gels where water is replaced with air. It was observed that in the clay/polymer/nanocellulose aerogels, clay platelets probably arrange to fill the pores between cellulose nanofibers in the sheet-like microstructure of the aerogel, making the aerogel less porous. The resulting aerogels were soft and had so far very limited mechanical strength.Hyödyntämällä biologisista materiaaleista ja rakenteista löydettyjä suunnitteluperiaatteita voitaneen valmistaa sellaisia vahvoja ja keveitä rakenteita, joiden valmistaminen perinteisillä tuotantomenetelmillä on vaikeaa. Biologisina malleina tällaisille uusille materiaaleille voidaan käyttää muiden muassa helmiäistä ja eräiden pesusienilajien lasista tukirankaa. Helmiäinen on kerrosrakenteensa ansioista ainakin sata kertaa sitkeämpää kuin sen pääasiallinen ainesosa, hauras aragoniitti. Helmiäisen murtamiseen tarvitaan paljon energiaa, sillä särön edetessä materiaalissa helmiäisen rakenne levittää kuormituksen ja vauriot tehokkaasti laajalle alueelle. Lasisienen tukirangassa biologinen komposiittimateriaali on yhdistetty optimoidusti muotoiltuun rakenteeseen. Tämä ristikkorakenne vaikuttaa olevan mekaanisesti mahdollisimman luja, kuitenkin sisältäen mahdollisimman vähä materiaalia. Myös nanokuituselluloosa on lupaava uusi, biologisesta lähteestä peräisin oleva materiaali. Selluloosa-nanokuitujen lujuuden ja puuperäisen selluloosan runsaan saatavuuden vuoksi selluloosa-nanokuidut ovat lupaava ainesosa uudenlaisiin materiaaleihin. Tässä työssä tutkittiin kahta lähestymistapaa vahvojen ja keveiden materiaalien valmistukseen. Suunnitteluun haettiin innoitusta elollisen luonnon ratkaisuista, ja materiaaleissa hyödynnettiin vahvaa luonnonmateriaalia, nanokuituselluloosaa. Ensimmäiseksi kehitettiin menetelmä, jolla voitiin valmistaa lasisienen rakennetta jäljitteleviä, makroskooppisista kuiduista koostuvia ristikoita nanokuituselluloosasta. Käyttäen 3D-tulostinta ja pikavalmistuksen periaatteita pystyttiin ohjelmoimaan ristikkorakenteiden valmistusta. Nanoselluloosasta valmistettujen makroskooppisten kuitujen havaittiin olevan vahvoja: vetolujuus oli 300 MPa. Kirjallisuuteen verrattuna äärimmäinen venymä oli yli kaksi kertaa suurempi, minkä vuoksi kuidut olivat huomattavasti sitkeämpiä. Ristisilloittamalla kemiallisesti selluloosa-nanokuituja makroskooppisten kuitujen sisällä pystyttiin parantamaan materiaalin suorituskykyä märässä ympäristössä. Tämän myötä materiaalia voi olla mahdollista hyödyntää biolääketieteellisissä sovelluksissa. 3D-tulostettujen ultrakeveiden ristikkorakenteiden havaittiin olevan merkittävästi lujempia vetokuormituksessa kuin puristuksessa. Ristikkorakenteissa ei kuitenkaan saatu hyödynnettyä yksittäisten kuitujen koko lujuuspotentiaalia. Kehittämällä ristikkojen valmistusprosesseja voitaneen saadaan aikaan erittäin vahvoja ja keveitä rakenteita. Lisäksi käytettiin helmiäistä jäljittelevää savi/polymeeri-komposiittimateriaalia yhdessä selluloosa-nanokuitujen kanssa aerogeelien valmistamiseen. Havaittiin, että savi/polymeeri/nanoselluloosaaerogeeleissä savihiutaleet todennäköisesti asettuivat täyttämään selluloosa-nanokuitujen väleihin jääviä huokosia aerogeelin mikrorakenteessa, ja näin aerogeelin huokoisuus pieneni. Tulokseksi saatiin pehmeitä aerogeelejä, joiden mekaaniset ominaisuudet olivat toistaiseksi vaatimattomat