Co-infecção entre vírus influenza e bactéria flagelada

Trypsin is required in the hemagglutinin (HA) cleavage to in vitro influenza viruses activation. This HA cleavage is necessary for virus cell entry by receptor-mediated endocytosis. Bacteria in the respiratory tract are potential sources of proteases that could contribute to the cleavage of influenza virus in vivo. From 47 samples collected from horses, pigs, and from humans, influenza presence was confirmed in 13 and these samples demonstrated co-infection of influenza with flagellated bacteria, Stenotrophomonas maltophilia from the beginning of the experiments. Despite treatment with antibiotics, the bacteria remained resistant in several of the co-infected samples (48.39%). These bacteria, considered opportunistic invaders from environmental sources, are associated with viral infections in upper respiratory tract of hosts. The protease (elastase), secreted by Stenotrophomonas maltophilia plays a role in the potentiation of influenza virus infection. Proteolytic activity was detected by casein agar test. Positive samples from animals and humans had either a potentiated influenza infectivity or cytopathic effect (CPE) in MDCK and NCI H292 cells, Stenotrophomonas maltophilia were always present. Virus and bacteria were observed ultrastructurally. These in vitro findings show that microbial proteases could contribute to respiratory complications by host protease activity increasing inflammation or destroying endogenous cell protease inhibitors.Tripsina é necessária na ativação da clivagem do vírus influenza A in vitro. Esta clivagem é importante para entrada do vírus na célula por endocitose mediada pelo receptor celular. Bactérias presentes no trato respiratório são fontes de proteases que podem contribuir na replicação do vírus influenza in vivo. Entre 47 amostras coletadas de cavalos, suínos e humanos, a influenza foi isolada e confirmada em 13 que estavam co-infectadas com bactéria flagelada: Stenotrophomonas maltophilia desde o início destes experimentos. Apesar do tratamento das amostras com antibióticos, as bactérias resistiram em diversas delas (48.39%). A protease (elastase), secretada pela Stenotrophomonas maltophilia, desenvolveu papel decisivo na potencialização da infecção pelo vírus influenza. Essa atividade proteolítica foi detectada pelo teste de ágar-caseína. Amostras positivas para o vírus influenza isolado em animais, bem como em humanos tiveram potencialização da infectividade (ECP) em células MDCK e NCI-H292, sempre que a Stenotrophomonas maltophilia esteve presente. Os referidos microorganismos, bactéria e vírus foram observados ultra-estruturalmente. Esses achados in vitro demonstram como complicações respiratórias podem ocorrer in vivo, através da contribuição de protease microbiana, provocando aumento da inflamação ou destruição dos inibidores celulares de proteases endógenas, nos hospedeiros susceptíveis à influenza

Anticorpo protetor anti influenza humana detectado em cavalos, como virose zoonótica

This study aimed to investigate the incidence of the influenza virus, and its interspecies transmission cycle among horses. A comparative serological survey was performed using horse sera following challenge with both specific (equine) and non-specific (human) influenza virus strains. Bleedings of the 22 horses were performed during the years 1999 and 2000. Following treatment with kaolin (20%), added in rooster erythrocytes suspension (50%), for removal of non-specific antibodies, sera were titered against both Human and Equine Influenza virus, by the Hemagglutination Inhibition Assay(HI), recommended by WHO. The HI results of horse serological responses demonstrate cross reaction between both the specific strain, A/Eq1 (H7N7) ( 62.75%) and A/Eq2 (H3N8) (60.65%), and the non- specific strains, type A (H1N1) (79.5%) and A (H3N2) (94.45%) and type B (77.75%). It was noteworthy the high percentage of protection responses in equine sera aginst the non-specific strains, as compared with the specific strains. This finding suggests direct interspecies transmission of influenza virus as zoonotic viruses, particulary for the type B strain which is considered restricted to humans. It was the first report, in Brazil. Further studies are required to achieve a complete understanding of the incidence of influenza in our environment.O objetivo deste estudo foi investigar em cavalos, a incidência do vírus influenza e seu ciclo de transmissão interespécies. Portanto, levantamento sorológico foi realizado em soro de cavalos, confrontados com ambas cepas, as específicas (eqüino) e não específicas (humana) deste vírus. Sangrias de cavalos realizadas nos anos de 1999 e de 2000, forneceram soros que, após tratamento com Caolim (20%) e hemácias de galo(50%) para remoção dos anticorpos inespecíficos, foram titulados contra ambas referidas cepas, através do teste de Inibição da Hemaglutinação (recomendado pela OMS). Os resultados, demonstraram que as respostas sorológicas dos cavalos apresentaram reação cruzada entre as cepas específicas e as não específicas. As porcentagens de títulos IH obtidos foram de 62,75% e de 60,65% para as cepas específicas A/Eq1 (H7N7) e A/Eq2 (H3N8), respectivamente. E às cepas não específicas essas porcentagens foram de: 79,05% para A (H1N1), de 94,45% para A (H3N2) e de 77,75% ao tipo B. O mais relevante nestes dados comparativos com vírus influenza, foi a alta porcentagem de resposta protetora à cepa não específica comparada àquela específica, detectada nos soros eqüinos. Considerando o fato de que o tipo B, deste vírus, ser restrito à espécie humana, portanto a resposta de proteção nos cavalos sugere uma direta transmissão interspécies, como em viroses zoonóticas. Os autores relatam pela primeira vez este tipo de evento no Brasil

Equine influenza: evaluation of the humoral immune response through the hemagglutination inhibition and single radial haemolysis, in vaccinated horses with commercial and experimental vaccines

Foram avaliadas, através de testes de inibição da hemaglutinação (Hl) e da hemólise radial simples (HRS),as respostas de anticorpos contra influenza em 4 lotes de eqüinos adultos. O grupo do lote 01 recebeu a imunizaçãocom 2 doses de vacina contra influenza, preparada experimentalmente no Instituto Butantan. Noslotes 02 e 03, regularmente imunizados contra a influenza, foram administradas doses de reforço anual coma vacina comercial e com a vacina experimental, respectivamente. O lote 04 foi o grupo controle da avaliação.Os resultados dos testes demonstraram que as médias de títulos de HRS e IH do lote 01 apresentaram diferenças ao nível de p < 0,001, com significante aumento das médias de títulos detectados nos soros após a 2- imunização. Não foram observadas diferenças significantes entre as médias de títulos de anticorpos em soros obtidos antes e após a dose de reforço anual dos eqüinos dos lotes 02 e 03, atribuindo-se a persistênciade nível de anticorpos protetores mantida após 1 ano da imunização  regular com vacina comercial. A conversão sorológica dos eqüinos do lote 01, à persistência dos títulos de anticorpos nos eqüinos dos lotes 02 e 03 e, ainda, os baixos títulos de anticorpos verificados nos eqüinos não vacinados do lote 04 comprovam o resultado da resposta sorológica das duas vacinas, a experimental e a comercial, avaliadas neste trabalho.Equine Influenza: evaluation of the humoral immune response through the hemagglutination inhibition and single radial haemolysis, in horses vaccinated with commercial and experimental vaccines. From 4 equine groups, the antibody protection levels against influenza were evaluted through the hemagglutination inhibition and single radial haemolysis. One group of these animals received immunization from 2 doses of influenza vaccine, of experimental preparation, at the Butantan Institute, São Paulo, Brasil (IB). Two other horse groups, regularly vaccinated received the annual booster dose from both commercial and experimental vaccines (IB). A control group remained without vaccination. Differences were observed among the antibody level medians of the serum samples harvested prior and post immunization of those vaccinated animals. No evident differences were detected among the antibody level medians from animals that received annual booster doses, due to the persistence of the protective antibody level, 12 months after the regular immunization. In the control group, the animals showed low antibody levels, for both serum samples. In fact these results suggested the good serologic response of both vaccines, the commercial and the experimental, tested preparations

Vírus influenza e bactéria proteolítica co-infectantes em trato respiratório de indivíduos com manifestações respiratórias

A role for proteolytic bacteria in the exacerbation of influenza virus has been shown in natural hosts such as pigs and humans. Four hundred seven samples were collected from the respiratory tract of individuals presenting clinical manifestations, during influenza season (2003-2005) in São Paulo City. The aim of this study was to evaluate the incidence of determined bacteria co-infecting virus in human respiratory tract. Tests, such as bacteriological, immunofluorescence (IF), RT/PCR and hemagglutination (HA) were used for bacterial and viral investigation. Thirty seven (9.09%) positive for influenza virus were screened by IF. The RT/PCR confirmed the presence of influenza virus in these samples. Bacterial and agar casein tests demonstrated that 18 (48.64%) individuals were infected with proteolytic bacteria such as Staphylococcus spp., Streptococcus spp. and Pseudomonas spp. Among these samples, 13 (35.13%) were co-infected with influenza A virus. Influenza type B, co-infecting bacteria were found in five (13.51%) samples. In vitro the S. aureus protease increased the influenza HA titer after contact for 30 min at 25 ºC. Results revealed the occurrence of co-infection with proteolytic bacteria and influenza in the evaluated individuals. This finding corroborates that virus versus bacteria synergism could be able to potentiate respiratory infection, increasing damage to hosts.O papel da bactéria proteolítica na exacerbação do vírus influenza tem sido demonstrado em hospedeiros naturais como porcos e humanos. Foram coletadas 407 amostras do trato respiratório de indivíduos apresentando manifestações clínicas, durante a estação da influenza (2003-2005) na cidade de São Paulo. Este trabalho teve como objetivo avaliar a incidência de determinadas bactérias que junto com vírus co-infectarem o trato respiratório humano. Testes bacteriológicos, e virológicos como imunofluorescência (IF), RT/PCR e hemaglutinação (HA) foram usados nas investigações viral e bacteriana. Pelo teste de IF foram selecionadas trinta e sete (9,09%) amostras positivas para o vírus influenza. A presença do vírus influenza foi confirmada pela técnica de RT/PCR. Pelos testes bacteriológicos e do agar caseina, verificou-se que 18 (48,64%) dos indivíduos foram infectados com bactérias proteolíticas tais como Staphylococcus spp., Streptococcus spp. e Pseudomonas spp. Destas amostras, 13 (35,13%) foram co-infectadas com vírus influenza tipo A, e 5 (13,51%) com influenza tipo B. No experimento in vitro com influenza e S. aureus, detectou-se aumento do título hemaglutinante deste vírus, após contacto de 30 min a 25 ºC. Os resultados obtidos revelaram a ocorrência de co-infecção com bactéria proteolítica e vírus influenza nos indivíduos avaliados. Estes achados corroboram com a investigação do sinergismo, entre bactéria e vírus, que poderia ser capaz de potencializar infecção respiratória, aumentando os riscos aos hospedeiros

Incidência do vírus influenza em cães adultos criados em áreas rural e urbana do estado de São Paulo, Brasil

A transmissão interespecífica do vírus influenza é relatada em estudo sobre influenza com animais domésticos desde 1970. Pássaros e mamíferos, incluindo o homem, são seus hospedeiros naturais, porém outros animais podem participar da sua epidemiologia. Foi investigada a incidência do vírus influenza em cães adultos criados em zonas rural (9, 19,56%) e urbana (37, 80,43%), do Estado de São Paulo. Os soros dos cães foram examinados pelo teste de inibição da hemaglutinação (IH), usando antígeno dos vírus influenza circulantes no Brasil. Nos cães rurais foram detectados títulos médios de 94,37, 227,88, 168,14 e 189,62 UIH/25 mL (unidades inibidoras de hemaglutinação/25 mL) para os subtipos H1N1, H3N2, H7N7, H3N8 de vírus influenza A, respectivamente, com diferenças estatisticamente significativas (pIn 1970, searching for the interspecies transmission of influenza viruses led to the first study on influenza viruses in domestic animals. Birds and mammals, including human beings, are their natural hosts; however, other animals may also play a role in the virus epidemiology. The objective was to investigate the incidence of influenza viruses in adult dogs raised in rural (9, 19.56%) and urban (37, 80.43%) areas in the state of São Paulo, Brazil. Dog serum samples were examined for antibodies to influenza viruses by the hemagglutination inhibition (HI) test using the corresponding antigens from the circulating viruses in Brazil. Dogs from rural areas presented antibodies to influenza A H3N2, and influenza A H7N7 and H3N8. In rural areas, dog sera displayed mean titers as 94.37, 227.88, 168.14, 189.62 HIU/25 µL for subtypes H1N1, H3N2, H7N7, H3N8, respectively. About 84% and 92% of dogs from urban areas exhibited antibodies to human influenza A H1N1 and H3N2, respectively, with statistical difference at p < 0.05 between the mean titers of antibodies to H1N1 and H3N2. About 92% and 100% were positive for H7N7 and H3N8, respectively. In dogs from urban areas, the mean titers of antibodies against influenza A H1N1, H3N2, H7N7 and H3N8, were 213.96, 179.42, 231.76, 231.35 HIU/25 µL respectively. The difference among them was not statistically significant at p &gt; 0.05. In conclusion, these dogs were positive for both human and equine influenza viruses. The present study suggests the first evidence that influenza viruses circulate among dogs in Brazil

Presença de vírus respiratórios em equinos do Brasil

Equines are susceptible to respiratory viruses such as influenza and parainfluenza. Respiratory diseases have adversely impacted economies all over the world. This study was intended to determine the presence of influenza and parainfluenza viruses in unvaccinated horses from some regions of the state of São Paulo, Brazil. Blood serum collected from 72 equines of different towns in this state was tested by hemagglutination inhibition test to detect antibodies for both viruses using the corresponding antigens. About 98.6% (71) and 97.2% (70) of the equines responded with antibody protective titers (≥ 80 HIU/25µL) H7N7 and H3N8 subtypes of influenza A viruses, respectively. All horses (72) also responded with protective titers (≥ 80) HIU/25µL against the parainfluenza virus. The difference between mean antibody titers to H7N7 and H3N8 subtypes of influenza A viruses was not statistically significant (p >; 0.05). The mean titers for influenza and parainfluenza viruses, on the other hand, showed a statistically significant difference (p ; 0,05). As médias de títulos dos vírus influenza e parainfluenza, por outro lado, demonstraram diferença estatisticamente significante (p < 0,001). Esses resultados indicam melhor resposta de anticorpos pelos equinos ao vírus parainfluenza 3 do que ao vírus da influenza equina. Nenhuma diferença estatística foi observada nas respostas contra os vírus da influenza equina A (H7N7 e H3N8) e parainfluenza 3, com relação ao gênero (fêmeas e machos) e grupo etário (≤ 2 até 20 anos) nos equinos avaliados. Este estudo fornece evidência da presença concomitante dos dois subtipos vírus influenza A (H7N7 e H3N8) e do parainfluenza 3 em cavalos no Brasil. Portanto, é aconselhável a vacinação dos cavalos contra esses vírus respiratórios

Effect of cell culture system on the production of human viral antigens Efeito do sistema de cultura celular na produção de antígenos virais humanos

A comparative study was performed in the production of different viral antigens by using microcarrier systems and traditional systems. Vero, BHK and MA 104 cells were cultivated in microcarriers (2mg/ml) using a bioreactor with a working capacity of 3.7 liters, in parallel with conventional Roux bottles. After four days (BHK cells), and seven days of culture (Vero and MA-104 cells), the cells were infected with 0.1 MOI (multiplicity of infection) of rabies virus, measles virus, poliovirus and rotavirus. The yields of the cells and virus in microcarriers and in the conventional system were determined. It was observed that in the microcarrier system, an average increase of twenty-fold more cells/ml was obtained in relation to the conventional monolayer culture, using Roux bottle. On the other hand, cells grown in Roux bottles presented 1.3 to 6.7 more viruses/ml culture than those in the microcarrier systems. However, the overall data showed that yieldings, in terms of viruses per batch, were statistically similar for both systems (p > 0.05). The amount of viral antigen production seems to depend not only on cell concentration, but also on other culture factors such as the characteristic of the cell-growth surface. Thus, the present findings provide a baseline for further improvements and strategies to be established for a scaling-up virus production since depending on the type of virus the optimal conditions found for a small-scale virus production seem unsuitable for large-scale production, requiring new standardization and evaluation.<br>Foi realizado estudo comparativo na produção de diferentes antígenos virais usando sistema de microcarregador e sistema tradicional. Células Vero, BHK e MA-104 foram cultivadas em microcarregadores (2mg/ml) utilizando-se biorreatores com capacidade de 3,7 litros e, em paralelo, no sistema convencional com garrafas Roux. Após quatro dias de cultura para as células BHK e sete dias para as células Vero e MA-104, as células foram infectadas com 0,1 MOI (multiplicidade de infecção) de vírus da raiva, vírus do sarampo, poliovírus e rotavírus. Foi determinado o rendimento das células e dos vírus em microcarregadores e sistema convencional. Foi observado no sistema de microcarregador um aumento médio obtido de vinte vezes mais células/ml em relação à cultura convencional em monocamadas, usando garrafas Roux. Por outro lado, as células que cresceram em garrafas Roux apresentaram 1,6 a 6,7 mais vírus/ml em culturas do que no sistema de microcarregador. Contudo o total das amostras em termos de vírus por grupo foi estatisticamente similar para ambos os sistemas (p > 0,05). O rendimento na produção de antígeno viral pode depender não somente da concentração das células, mas também de outros fatores da cultura, como características do suporte no crescimento. Assim, o estudo deste parâmetro pode proporcionar uma linha de base para um futuro melhoramento e estratégias para se estabelecer um aumento em escala na produção de vírus, já que, dependendo do tipo de vírus, a ótima condição encontrada para uma produção de vírus em pequena escala pode não ser adequada para a produção em grande escala, requerendo novas padronização e avaliação