Optimization of in vitro organogenesis in passion fruit (Passiflora edulis f. flavicarpa)

A organogênese in vitro de maracujá foi estudada pela indução de gemas adventícias em discos de folha cultivados em meio de cultura suplementado com benziladenina (BAP) ou thidiazuron (TDZ). Nitrato de prata (AgNO3) foi adicionado ao meio de cultura de indução de gemas adventícias para minimizar o efeito do acúmulo de etileno no desenvolvimento dos brotos. Tanto BAP (0; 2,2; 4,4; 6,6 µmol L-1) como TDZ (0; 1,1; 2,2; 3,4 µmol L-1) foram eficientes em promover o desenvolvimento de brotos. Embora diferenças significativas no uso de AgNO3 (23,5 µmol L-1) não tenham sido detectadas, gemas adventícias desenvolvidas em meio de cultura suplementado com AgNO3 eram mais vigorosas. O número de explantes com gemas obtidos no meio de cultura suplementado com TDZ e AgNO3 (5,6) foi maior do que aquele obtido com BAP e AgNO3 (3,0). Os meios de cultura MSM + ácido giberélico (GA3), MSM + água de coco ou ½ MSM foram utilizados para o alongamento dos brotos, os quais foram incubados em frascos com tampas ventiladas ou tampas normais. Os melhores resultados foram obtidos cultivando-se as gemas adventícias no meio de cultura MSM + água de coco em frascos com tampas ventiladas. As plântulas transferidas para meio de cultura MSM + ácido indol butírico enraizaram num período de 30 dias. A organogênese in vitro de maracujazeiro foi otimizada utilizando-se TDZ + AgNO3 para a indução de gemas adventícias. A transferência das gemas para meio de cultura MSM + água de coco e a incubação em frascos com tampas ventiladas favoreceu o alongamento e o desenvolvimento de plântulas.In vitro organogenesis of passion fruit was studied by the induction of adventitious buds from leaf discs in culture media supplemented with benzyladenine (BAP) or thidiazuron (TDZ). To minimize adverse effects of ethylene accumulation on shoot development, silver nitrate (AgNO3) was added to the induction media. Both BAP (0; 2.2; 4.4; 6.6 µmol L-1) and TDZ (0; 1.1; 2.2; 3.4 µmol L-1) were effective in promoting shoot development. Although no significant differences were detected using AgNO3 (23.5 µmol L-1), buds grown in AgNO3-supplemented media were more vigorous. The number of explants with buds obtained using TDZ and AgNO3-supplemented media (5.6) were higher than those obtained using BAP and AgNO3 (3.0). MSM + giberrellic acid (GA3), MSM + coconut water, and ½ MSM culture media were tested for shoot bud elongation, incubated in flasks covered with either non-vented or vented lids. Best results were obtained by culturing buds in MSM + coconut water media in flasks covered with vented lids. Plantlets transferred to MSM + indol butyric acid (IBA) media rooted in a 30-day period. Passion fruit organogenesis was enhanced by using TDZ and AgNO3 for bud induction. Transferring the buds to MSM + coconut water media and incubating in flasks with vented lids favored shoot elongation and plantlet development

Somatic embryogenesis from calli of sweet orange cultivars

A regeneração de plantas, por organogênese ou embriogênese somática, a partir do cultivo de células e tecidos vegetais in vitro, é a base para a utilização da biotecnologia no melhoramento. O objetivo deste trabalho foi avaliar a embriogênese somática a partir de calos embriogênicos das cultivares de laranjeiras doces 'Hamlin', 'Pêra', 'Natal', 'Lima Verde' e 'Westin', em função da composição dos meios de cultura relacionada à fonte e concentração de diferentes carboidratos, utilizando-se meio de cultura MT modificado com 500mg L-1 de extrato de malte, acrescido de sacarose, galactose, glicose, sorbitol, lactose ou maltose, nas concentrações de 18, 37, 75, 110 ou 150mM à 27°C. O delineamento experimental utilizado foi inteiramente casualizado, em esquema fatorial cinco (cultivares) x seis (fontes de carboidratos) x cinco (concentrações das fontes de carboidratos no meio de cultura), com cinco repetições. A formação de embriões somáticos variou conforme a cultivar, e as laranjeiras 'Hamlin' e 'Natal' registraram o maior número de embriões, enquanto 'Lima Verde' e 'Westin' apresentaram menores números. A melhor fonte de carboidratos para indução de embriogênese somática foi a maltose, seguida pela lactose, nas concentrações de 37 e 75mM. Embriogênese somática não foi observada nos meios de cultura contendo galactose, glicose ou sorbitol para nenhuma cultivar estudada.Plant regeneration, by organogenesis or somatic embryogenesis, from cell cultures and in vitro plant tissue culture is the basis for biotechnology usage in plant breeding. This research aimed to evaluate somatic embryogenesis from embryogenic calli of 'Hamlin', 'Pêra', 'Natal', 'Lima Verde', and 'Westin' sweet orange cultivars related to culture medium composition as source and concentration of carbohydrates with the use of MT culture medium modified with 500mg L-1 of malt extract, supplemented with sucrose, galactose, glucose, maltose, lactose, or sorbitol at concentrations of 18, 37, 75, 110 or 150mM at 27°C. Statistical design were complete randomized, in a factorial five (cultivars) x six (carbohydrate source) x six (carbohydrate concentration in culture medium) with five replicates. The production of somatic embryos varied with the genotype, as 'Hamlin' and 'Natal' cultivars registered higher number of embryos, whereas 'Lima Verde' and 'Westin' showed lower numbers. The best carbohydrate source was maltose, followed by lactose at concentrations of 37 and 75mM. Somatic embryogenesis was not observed on culture media supplemented with galatose, glucose or sorbitol in any studied cultivar

Rooting of 'caipira' sweet orange + 'Volkamer' lemon somatic hybrid cuttings and their progenitors

Objetivou-se neste trabalho comparar o enraizamento de estacas do híbrido somático laranja 'Caipira' (C. sinensis L. Osbeck) + limão 'Volkameriano' (C. volkameriana V. Tennore et Pasquale) com aquelas dos seus genitores tratadas com ácido indolbutírico (AIB) (0; 500; 1.000 e 2.000 mg L-1). As estacas de laranja 'Caipira' e limão 'Volkameriano' foram retiradas de plantas obtidas a partir de sementes, e as do híbrido somático, de plantas enxertadas recém-podadas. O delineamento experimental utilizado foi um fatorial 3 x 4 (genótipos x concentrações de AIB) inteiramente casualizado, com quatro repetições de 10 estacas por repetição, totalizando 480 estacas. As estacas foram cultivadas em bandejas de poliestireno expandido, contendo substrato comercial, em estufa com sistema de nebulização intermitente, por 90 dias. A produção de plantas enraizadas foi altamente eficiente para os três genótipos avaliados, considerando-se a maioria das variáveis relacionadas ao enraizamento e vigor das estacas, independentemente do uso de AIB. Estacas de limão 'Volkameriano' apresentaram médias de comprimento e massa seca das raízes superiores às dos demais genótipos. Para todos os genótipos, as porcentagens de estacas vivas e enraizadas foram elevadas (acima de 90%), indicando o alto potencial deste germoplasma para ser utilizado na produção de mudas e porta-enxertos por estaquia.This work aimed to compare the rooting capacity of cuttings of the somatic hybrid 'Caipira' sweet orange (C. sinensis L. Osbeck) + 'Volkamer' lemon (C. volkameriana V. Tennore et Pasquale) with those of their progenitors treated with indol butyric acid (IBA) (0, 500, 1000 and 2000 mg L-1). Cuttings of 'Caipira' sweet orange and 'Volkamer' lemon were collected from seed derived plants, whereas those of the somatic hybrid were obtained from recently pruned grafted plants. The experimental design was a completely randomized block 3 x 4 factorial (genotypes x IBA concentrations), with four replications (10 cuttings per replication) in a total of 480 cuttings. Cuttings were cultivated in expanded polystyrene trays filled with commercial potting mix, inside an intermittent mist chamber, for 90 days. The production of the rooted plants was highly efficient for the three genotypes evaluated, considering most of the variables related with rooting and cutting vigor, regardless the use of IBA. 'Volkamer' lemon cuttings had higher root length and root dry mass than the other genotypes. However, percentage of live cuttings, rooted cuttings and sprouted cuttings were high (above 90%) for all evaluated genotypes, indicating the great potential of this material to be used in nursery tree multiplication through cuttings

Silenciamento gênico: conceitos, aplicações e perspectivas em plantas lenhosas

RNA interference, transcriptional gene silencing, virus induced gene silencing, and micro RNAs comprise a series of mechanisms capable of suppressing gene expression in plants. These mechanisms reveal similar biochemical pathways and appear to be related in several levels. The ability to manipulate gene silencing has produced transgenic plants able to switch off endogenous genes and invading nucleic acids. This powerful biotechnological tool has provided plant breeders and researchers with great opportunity to accelerate breeding programs and developmental studies in woody plants. This research work reports on gene silencing in woody plants, and discuss applications and future perspectives.RNA de interferência, silenciamento gênico transcricional, silenciamento gênico induzido por vírus e micro RNAs compõem uma série de mecanismos capazes de suprimir a expressão gênica em plantas. Estes mecanismos revelaram rotas metabólicas parecidas e interagem em vários níveis. A capacidade de manipular técnicas de silenciamento gênico tem produzido plantas transgênicas capazes de suprimir a expressão de genes endógenos e ácidos nucléicos invasores. Esta poderosa ferramenta biotecnológica tem ofertado a possibilidade de acelerar programas de melhoramento e pesquisas em desenvolvimento de plantas lenhosas. Este trabalho visa revisar pesquisas de silenciamento gênico em plantas lenhosas e discutir aplicações e rumos futuros

Regeneração de gemas de laranja-azeda e desenvolvimento in vitro de plantas em função da composição do meio de cultura e tipo de explante

In order to evaluate the formation of adventitious buds and in vitro regeneration of sour orange plants (Citrus aurantium L.) two organogenesis-inducing experiments were conducted. In the first experiment, the induction and in vitro regeneration of adventitious buds were tested on epicotyl and internodal segments under the influence of BAP or KIN associated with NAA. The second experiment evaluated the in vitro regeneration of sour orange plants related to different explant types (epicotyls segments, internodal segments of in vitro germinated plantlets and internodal segments of greenhouse cultivated plants). Data collected on both experiments included the percentage of responsive explants (explants that formed buds), and the number of buds per explant. The addition of BAP showed the best organogenic response. In vitro germinated epicotyl segments and internodal segments are recommended as explants for sour orange in vitro organogenesis. Rooting of regenerated shoots was achieved without the need of auxin in the medium.Com o objetivo de avaliar a formação de gemas adventícias e regeneração in vitro de plantas de laranja-azeda (Citrus aurantium L.), foram realizados dois experimentos de indução à organogênese. No primeiro experimento, a indução e a regeneração in vitro de gemas adventícias foram investigadas a partir de segmentos internodais e segmentos de epicótilo sob o efeito de BAP ou CIN associados com ANA. O segundo experimento avaliou a regeneração in vitro de plantas de laranja-azeda em função do tipo de explante (segmentos de epicótilo, segmentos internodais de plantas germinadas in vitro e segmentos internodais de plantas cultivadas em casa de vegetação). Os dados coletados em ambos os experimentos incluíram a porcentagem de explantes responsivos (explantes que formaram gemas) e número de gemas por explante. A adição de BAP revelou a melhor resposta organogenética. Segmentos de epicótilo e segmentos internodais são explantes recomendados para a indução de organogênese in vitro de laranja-azeda. Enraizamento das brotações foi alcançado sem a adição de auxinas ao meio de cultura

Embriogênese somática em Citrus sinensis, C. reticulata E C. nobilis x C. deliciosa

A maioria dos processos de regeneração de plantas em citros por cultura de tecidos envolve embriogênese somática indireta. A otimização desse processo é importante para o desenvolvimento de trabalhos de melhoramento in vitro e micropropagação. Realizaram-se estudos em calos de tangerina 'Ponkan' (Citrus reticulata Blanco), tangerina 'Cravo' (C. reticulata), laranja 'Itaboraí' (C. sinensis L. Osbeck.), laranja 'Valência' (C. sinensis) e tangerina 'Kinnow' (C. nobilis Loureiro x C. deliciosa, Tenore) visando avaliar o efeito de diferentes carboidratos na embriogênese somática. Utilizou-se o meio MT acrescido de sacarose, galactose, glicose, maltose e lactose nas concentrações de 18, 37, 75, 110 e 150 mM. O meio de cultura utilizado para a maturação dos embriões somáticos continha sacarose nas concentrações de 0, 15, 29, 44, 58 e 73 mM, na presença ou não de 0,5 g L;-;1 de carvão ativado; 73 mM de sacarose e GA3 na concentração de 0,1 mg L;-;1, na presença ou não de 0,5 g L;-;1 de carvão ativado. O estímulo à embriogênese somática foi mais eficiente em meio de cultura suplementado com lactose e galactose. Quanto à maturação de embriões, os meios de cultura contendo 58 e 73 mM de sacarose foram aqueles que geraram um maior número de plantas em tangerina 'Ponkan' e laranja 'Valência'.Most of the plant regeneration processes in citrus, through tissue culture, involve indirect somatic embryogenesis. The optimization of these processes is important for the development of in vitro plant improvement and micropropagation studies. Studies to evaluate the effect of different carbohydrates in somatic embryogenesis were conducted using calli from 'Ponkan' mandarin (Citrus reticulata, Blanco), 'Cravo' mandarin (C. reticulata), 'Itaboraí' sweet orange (C. sinensis L. Osbeck.), 'Valencia' sweet orange (C. sinensis) and 'Kinnow' mandarin (C. nobilis Loureiro x C. deliciosa Tenore). The culture medium used was MT supplemented with sucrose, galactose, glucose, maltose or lactose with the following concentrations of 18, 37, 75, 110, and 150 mM. The culture medium used for the maturation of somatic embryos had 0, 15, 29, 44, 58 and 73 mM of sucrose, in presence or absence of 0.5 g L;-;1 of activated charcoal. Seventy-three mM of sucrose with 0.1 mg L;-;1 of GA3 in the presence or absence 0.5 g L;-;1 of activated charcoal was also tested. Overall, the carbohydrates galactose or lactose induced a higher number of somatic embryos. Sucrose concentrations of 58 and 73 mM generated a higher number of plantlets from mature embryos of 'Ponkan' mandarin and 'Valencia' sweet orange

Organogênese in vitro em cotilédones de melancia

The objective of this work was to study the in vitro organogenesis of Citrullus lanatus, by the induction of adventitious buds in cotyledon segments cultured in medium supplemented with cytokinin. Explants were collected from one, three and five-day-old in vitro germinated seedlings, considering the distal and proximal cotyledon regions. The data obtained showed that in vitro organogenesis of watermelon occurred with higher efficiency, when cotyledon segments from the proximal region collected from three-day-old seedlings were cultivated in medium MS, supplemented with BAP (1 mg L-l) and coconut water (10%). The histological study showed that the organogenesis occurs directly, without callus formation, on epidermal and subepidermal layers of the explants. Adventitious shoots were characterized by the development of shoot apical meristem and leaf primordia. The formation of protuberances, that do not develop into adventitious buds, was also observed.O objetivo do trabalho foi estudar a organogênese in vitro de C. lanatus, pela indução de gemas adventícias, em segmentos de cotilédones, cultivados em meio de cultura suplementado com citocinina. Os explantes consistiram de segmentos das regiões distal e proximal de cotilédones, coletados de plantas germinadas in vitro com um, três e cinco dias de idade. Os dados obtidos mostram que a organogênese de melancia, in vitro, ocorre com maior eficiência em segmentos da região proximal dos cotilédones, coletados de plântulas com três dias de idade e cultivados em meio de cultura MS, suplementado com a combinação BAP (1 mg L-l) e água de coco (10%). Pelo estudo histológico, verificou-se que a organogênese ocorre diretamente, sem a formação de calo, na epiderme e subepiderme do explante. As gemas adventícias foram caracterizadas pela presença de meristema apical e primórdios foliares. Observou-se, também, o desenvolvimento de protuberâncias que não se desenvolvem em gemas adventícias

In vitro induction and culture of adventitious buds in epicotyl segments of sour orange

O objetivo deste trabalho foi avaliar a indução e a formação de gemas adventícias em explantes de laranja-azeda, pelo uso de fi torreguladores. Em experimentos de organogênese in vitro foram avaliados 6-benzilaminopurina (BAP), thidiazuron (TDZ) e cinetina (CIN), cem diferentes concentrações e sob duas ondições de luminosidade; BAP e CIN combinados ou não com ácido naftalenoacético (ANA); e BAP eCIN isoladamente ou combinados entre si. Segmentos de epicótilo de 1 cm de comprimento, provenientes de plântulas de laranja-azeda germinadas in vitro, foram utilizados como explantes. Para induzir a formação de gemas, os segmentos foram cultivados em meio MT com ou sem adição de fi torreguladores. O material foi cultivado a 27ºC em ausência de luz por 30 dias, seguidos de fotoperíodo de 16 horas. O delineamento experimental foi inteiramente casualizado, com quatro ou cinco repetições, a depender do experimento e, cadarepetição foi constituída de placa de Petri com 20 explantes. Após 60 ou 70 dias de cultivo foram avaliados o percentual de explantes responsivos e o número de gemas por explante. A adição de BAP ao meio de cultura,combinada ou não com ANA, e em combinações com CIN promovem melhor resposta organogênica.The objective of this work was to evaluate the induction and formation of adventitious buds in sour orange explants through the use of plant regulators. In vitro organogenesis experiments were conducted to evaluate the effect of BAP, TDZ, and KIN in different concentrations and under two light conditions; BAP and KIN, combined or not with NAA; BAP and KIN, separately or in combined concentrations. Sour orange epicotyl segments (1 cm length), from in vitro germinated plants, were used as explants. In order to induce bud formation, the explants were cultured in MT medium with or without the addition of plant regulators. The material was cultivated at 27ºC in the absence of light for 30 days, followed of culture under a 16-hour photoperiod. The experimental design was completely randomized, with four or five replicates, depending on the experiment; each replicate comprised one Petri dish with 20 explants. After 60 or 70 days of cultivation, the percentage of responsive explants and the number of buds were evaluated. The addition of BAP to the culture medium, combined or not with ANA, and in combinations with CIN, induces better organogenic response

Otimização do processo de organogênese in vitro e regeneração de plantas em Citrus sinensis E C. limonia

Com o desenvolvimento de novas técnicas biotecnológicas, é possível a introdução no genoma vegetal de genes de outras plantas ou outros organismos pela transformação genética. Entretanto, um dos principais requisitos para o sucesso desta técnica é a existência de uma metodologia eficiente de regeneração de plantas in vitro. O objetivo deste trabalho foi definir protocolos de regeneração de plantas, via organogênese, para laranjas 'Natal', 'Valência' e 'Hamlin' (Citrus sinensis L. Osbeck), e limão 'Cravo' (Citrus limonia L. Osbeck), para obtenção de plantas transgênicas nestas variedades. Sementes sem tegumentos foram germinadas in vitro durante três semanas no escuro e uma semana sob fotoperíodo de 16 h (40 µmol m-2 s-1), a 27 ± 2°C. Para indução das brotações, segmentos de epicótilo foram cultivados no meio de cultura MT (25 g L-1 de sacarose) suplementado com diferentes concentrações de benzilaminopurina (BAP). Para enraizamento, utilizou-se meio MT, com ou sem a adição de NAA ou IBA (1,0 mg L-1). A combinação 1,0 mg L-1 BAP, utilizada na fase de indução de brotações e 1,0 mg L-1 IBA, utilizada na fase de enraizamento, permitiu regeneração de plantas com bom índice de enraizamento nas três variedades de laranjas. A utilização de 0,5-2,5 mg L-1 BAP na fase de indução de brotações, com 1,0 mg L-1 IBA na fase de enraizamento, assegurou regeneração de plantas com alto índice de enraizamento para o limão 'Cravo'. Os protocolos de organogênese desenvolvidos neste trabalho podem ser utilizados em experimentos de transformação genética envolvendo essas variedades.Exogenous genes can be introduced in plants by genetic transformation techniques. However, an efficient tissue culture system with high rates of plant recovery is necessary for gene introduction. This work aimed to define organogenesis and plant regeneration protocols for sweet orange varieties Natal, Valencia and Hamlin (Citrus sinensis L. Osbeck) and Rangpur lime (Citrus limonia L. Osbeck) which can be used in plant transformation experiments. Seeds of which teguments were removed, were germinated in vitro and maintained in the dark for three weeks, followed by one week at 16-h photoperiod (40 µmol m-2 s-1) and 27 ± 2°C. Organogenesis induction was done by introducing epicotyl segments in MT medium with 25 g L-1 sucrose and different BAP concentrations. After adventitious bud growth, the shoots were transferred to MT medium with either NAA or IBA (1 mg L-1), or absence of auxin, for rooting. The best results were obtained with 1 mg L-1 BAP for bud induction and 1 mg L-1 IBA for rooting for all three sweet orange cultivars. The use of 0.5-2.5 mg L-1 BAP, followed by 1 mg L-1 IBA were the best growth regulator combinations for bud induction and rooting, respectively, for 'Rangpur' lime. The protocols presented in this work are suitable for associations with genetic transformation experiments for these cultivars

In vitro organogenesis from internodal segments of adult sweet orange plants

O objetivo deste trabalho foi otimizar a regeneração in vitro via organogênese a partir de tecidos de plantas adultas das laranjas doces 'Hamlin', 'Pêra' e 'Valência'. Os explantes foram cultivados em meio EME com diferentes concentrações de 6-benzilaminopurina (BAP) e ácido naftalenoacético (ANA), a 27ºC sem luz por 50 dias, seguido de fotoperíodo de 16 horas por 20 dias. A regeneração foi avaliada 50 e 70 dias após o cultivo in vitro. A organogênese nas cultivares Hamlin e Valência foi favorecida pelo uso de EME suplementado com BAP, enquanto ANA não apresentou efeito aparente.The objective of this work was to optimize in vitro plant regeneration via organogenesis from tissues of adult 'Hamlin', 'Pêra', and 'Valência' sweet orange plants. Explants were grown in EME culture medium with different concentrations of 6-benzylaminopurine (BAP) and naphthaleneacetic acid (NAA), at 27ºC in the absence of light for 50 days, followed by a 16-hour photoperiod for 20 days. Regeneration was assessed 50 and 70 days after in vitro culture. Organogenesis in cultivars Hamlin and Valência was promoted by EME supplemented with BAP, while NAA showed no apparent effect