Ανάλυση μηχανισμών λειτουργίας Τ κυτταρικών προϊόντων κατά την κυτταρική ανοσοθεραπεία

Allogeneic haematopoietic cell tranplantation (Allo-HCT) has become a standard treatment for patients with marrow failure syndromes and hematologic malignancies such as acute leukaemia. However, this treatment is frequently accompanied by the occurrence of Graft-versus-Host Disease (GvHD), a common life-threatening complication in which donor-derived T cells recognise and attack the host’s normal tissues. This phenomenon can occur either early (aGvHD) or later (cGvHD) following allo-HCT and can transpire even when aggressive immunosuppressive prophylaxis is given or even when the donor is an HLA-matched sibling. Despite ground-breaking discoveries in GvHD pathobiology and advances in our understanding of the underlying mechanisms of this disease, conventional immunosuppressive pharmacotherapy remains the backbone of GvHD prophylaxis and treatment. A promising alternative strategy against GvHD is immunotherapy employing the adoptive transfer of T-cells with regulatory properties (Tregs) as a living drug aiming to avoid prolonged pharmacological immunosuppression while preserving the beneficial Graft-versus-Leukaemia effect. Our approach aspired to mimic the physiological mechanism of the successful immune tolerance transpiring during pregnancy, where HLA-G -a well-known immunoregulatory molecule- is expressed in the placenta thereby guarding the “semi-allogeneic” fetus from maternal immune rejection. Since the HLA-G gene is epigenetically repressed after prenatal life and the methylation status of HLA-G promoter regulates its transcriptional activity, we showed in small-scale in vitro experiments that exposure of human peripheral T cells to hypomethylating agents (Has) induces a de novo and stable expression of HLA-G, in turn, converting them to Tregs with in vitro immunosuppressive functions. Subsequently, we developed and validated the manufacturing process of a HLA-G+ T cell (G+ cell)-enriched product, termed iG-Tregs, using a clinical scale and GMP-grade protocol. iG-Tregs can be consistently and robustly produced and display suppressive properties with a favourable safety profile both in vitro and in vivo. The current thesis plays a pivotal part in the translation journey of iG-Tregs as it focuses on elucidating the molecular aspects of G+ cell biology, the design of an interventional clinical trial to translate iG-Tregs as adoptive cell immunotherapy in the context of GvHD post allo-HCT and finally to provide a framework upon which to gain insight into the biological events occurring following this treatment in the human in vivo setting.Η αλλογενής μεταμόσχευση αιμοποιητικών κυττάρων (Allo-HCT) αποτελεί μια καθιερωμένη θεραπεία για ασθενείς με σύνδρομα μυελικής ανεπάρκειας και αιματολογικές κακοήθειες όπως η οξεία λευχαιμία. Ωστόσο, αυτή η θεραπεία συχνά συνοδεύεται από την εμφάνιση της νόσου του μοσχεύματος έναντι του ξενιστή (GvHD), μιας απειλητικής για τη ζωή επιπλοκής στην οποία τα Τ κύτταρα που προέρχονται από τον δότη αναγνωρίζουν και επιτίθενται τους φυσιολογικούς ιστούς του ξενιστή. Αυτό το φαινόμενο μπορεί να συμβεί είτε νωρίς (acute GvHD) είτε αργότερα (chronic GvHD) μετά από την allo-HCT και μπορεί να εμφανιστεί ακόμη και όταν χορηγείται ισχυρή ανοσοκατασταλτική προφύλαξη ή ακόμα και όταν ο δότης είναι HLA συμβατός αδερφός. Παρά τις πρωτοποριακές ανακαλύψεις στην παθοβιολογία της GvHD και τις προόδους στην κατανόηση των υποκείμενων μηχανισμών αυτής της νόσου, η συμβατική ανοσοκατασταλτική φαρμακοθεραπεία παραμένει η κύρια παρέμβαση για την προφύλαξη και θεραπεία έναντι της GvHD. Μια πολλά υποσχόμενη εναλλακτική στρατηγική κατά της GvHD είναι η ανοσοθεραπεία που χρησιμοποιεί τη υιοθετούμενη θεραπεία με Τ ρυθμιστικά κύτταρα (Tregs) ως ζωντανό φάρμακο με στόχο την αποφυγή παρατεταμένης φαρμακολογικής ανοσοκαταστολής διατηρώντας παράλληλα το ευεργετικό αποτέλεσμα Μοσχεύματος έναντι Λευχαιμίας.Η προσέγγισή μας φιλοδοξούσε να μιμηθεί τον φυσιολογικό μηχανισμό της επιτυχούς ανοσολογικής ανοχής που λαμβάνει χώρα κατά τη διάρκεια της εγκυμοσύνης, όπου το HLA-G -ένα πολύ γνωστό ανοσορυθμιστικό μόριο- εκφράζεται στον πλακούντα προστατεύοντας έτσι το «ημι-αλλογενές» έμβρυο από μητρική ανοσολογική απόρριψη. Δεδομένου ότι το γονίδιο HLA-G καταστέλλεται επιγενετικά και ότι η μεθυλίωση του εκκινητή του γονιδίου ρυθμίζει τη μεταγραφική του δραστηριότητα, δείξαμε σε μικρής κλίμακας in vitro πειράματα ότι η έκθεση ανθρώπινων περιφερικών Τ κυττάρων σε υπομεθυλιωτικούς παράγοντες (HA) επάγει de novo και σταθερή έκφραση του HLA-G, μετατρέποντάς τα σε Tregs με in vitro ανοσοκατασταλτικές λειτουργίες. Στη συνέχεια, αναπτύξαμε και επικυρώσαμε τη διαδικασία κατασκευής ενός προϊόντος εμπλουτισμένου με HLA-G+ T κύτταρα (G+ κύτταρα), που ονομάζεται iG-Tregs, χρησιμοποιώντας ένα κλινικής κλίμακας και GMP-βαθμού πρωτόκολλο. Τα παραγόμενα iG-Tregs εμφανίζουν κατασταλτικές ιδιότητες με ευνοϊκό προφίλ ασφάλειας τόσο in vitro όσο και in vivo.Η παρούσα διατριβή παίζει καθοριστικό ρόλο στο μεταφραστικό ταξίδι των iG-Tregs καθώς εστιάζει στην αποσαφήνιση των μοριακών πτυχών της κυτταρικής βιολογίας των G+ κυττάρων, στο σχεδιασμό μιας παρεμβατικής κλινικής δοκιμής για τη μετάφραση των iG-Tregs ως υιοθετούμενης κυτταρικής ανοσοθεραπείας έναντι της ανάρτησης GvHD σε ασθενείς που υποβάλλονται σε allo-HCT και τέλος στην ανάπτυξη ενός πλαισίου ανοσολογικής επιτήρησης των ασθενών για την αποσαφήνιση των βιολογικών γεγονότων που συμβαίνουν μετά από τη χορήγηση iG-Tregs in vivo

Empowering the Potential of CAR-T Cell Immunotherapies by Epigenetic Reprogramming

T-cell-based, personalized immunotherapy can nowadays be considered the mainstream treatment for certain blood cancers, with a high potential for expanding indications. Chimeric antigen receptor T cells (CAR-Ts), an ex vivo genetically modified T-cell therapy product redirected to target an antigen of interest, have achieved unforeseen successes in patients with B-cell hematologic malignancies. Frequently, however, CAR-T cell therapies fail to provide durable responses while they have met with only limited success in treating solid cancers because unique, unaddressed challenges, including poor persistence, impaired trafficking to the tumor, and site penetration through a hostile microenvironment, impede their efficacy. Increasing evidence suggests that CAR-Ts’ in vivo performance is associated with T-cell intrinsic features that may be epigenetically altered or dysregulated. In this review, we focus on the impact of epigenetic regulation on T-cell differentiation, exhaustion, and tumor infiltration and discuss how epigenetic reprogramming may enhance CAR-Ts’ memory phenotype, trafficking, and fitness, contributing to the development of a new generation of potent CAR-T immunotherapies

DataSheet_1_Hypomethylation-induced regulatory programs in T cells unveiled by transcriptomic analyses.docx

Regulatory T cells (Tregs) are essential mediators of tolerance mitigating aberrant immune responses. While naturally occurring Treg (nTreg) development and function are directed by epigenetic events, induced Treg (iTreg) identity and mechanisms of action remain elusive. Mirroring the epigenetic circuits of nTregs, we and others have used hypomethylation agents (HAs) to ex vivo convert T cells into iTregs (HA-iTregs) and further showed that the suppressive properties of the HA-iTregs are predominantly confined in an emergent population, which de novo expresses the immunomodulatory molecule HLA-G, consequently providing a surface marker for isolation of the suppressive HA-iTreg compartment (G+ cells). We isolated the HA-induced G+ cells and their G− counterparts and employed high-throughput RNA-sequencing (RNA-seq) analyses to uncover the G+-specific transcriptomic changes guiding T cells toward a regulatory trajectory upon their exposure to HA. We found a distinct transcriptional upregulation of G+ cells accompanied by enrichment of immune-response–related pathways. Although single-cell RNA-seq profiling revealed regulatory G+ cells to have molecular features akin to nTregs, when assessed in conjunction with the comparative transcriptomic analysis and profiling of secreted cytokines against the non-suppressive G− cells, FOXP3 and other T-helper signatures appear to play a minor role in their suppressive phenotype. We found an ectopic expression of IDO-1 and CCL17/22 in G+ cells, denoting that in vitro exposure of T cells to HA may well unlock myeloid suppressor genes. This report provides transcriptional data shaping the molecular identity of a highly purified and potent HA-iTreg population and hints toward ectopic myeloid-specific molecular mechanisms mediating HA-iTreg function.</p

Study protocol: Phase I/II trial of induced HLA-G+ regulatory T cells in patients undergoing allogeneic hematopoietic cell transplantation from an HLA-matched sibling donor

Regulatory T-cell (Treg) immunotherapy has emerged as a promising and highly effective strategy to combat graft-versus-host disease (GvHD) after allogeneic hematopoietic cell transplantation (allo-HCT). Both naturally occurring Treg and induced Treg populations have been successfully evaluated in trials illustrating the feasibility, safety, and efficacy required for clinical translation. Using a non-mobilized leukapheresis, we have developed a good manufacturing practice (GMP)-compatible induced Treg product, termed iG-Tregs, that is enriched in cells expressing the potent immunosuppressive human leucocyte antigen-G molecule (HLA-G+). To assess the safety and the maximum tolerable dose (MTD) of iG-Tregs, we conduct a phase I–II, two-center, interventional, dose escalation (3 + 3 design), open-label study in adult patients undergoing allo-HCT from an HLA-matched sibling donor, which serves also as the donor for iG-Treg manufacturing. Herein, we present the clinical protocol with a detailed description of the study rationale and design as well as thoroughly explain every step from patient screening, product manufacturing, infusion, and participant follow-up to data collection, management, and analysis (registered EUDRACT-2021-006367-26)