Insights into Candida tropicalis virulence factors

Tese de doutoramento em Engenharia BiomédicaCandida tropicalis is a common species related to nosocomial infections, namely candidemia and candiduria. Several virulence factors seem to be responsible for C. tropicalis infections, which present high potential for dissemination and mortality. Adhesion to surfaces (medical devices and host cells) and biofilm formation, are considered important factors that contribute to the development of candidosis. Hence, the colonization of indwelling devices like urinary catheters by C. tropicalis poses a critical problem. Further, adhesion and invasion of host cells by C. tropicalis is considered the first step to initiate systemic infections. Once adhered to epithelium, C. tropicalis are able to secrete hydrolytic enzymes that cause damage in host cells membrane integrity, leading to dysfunction or disruption of host structures. Thus, the main aim of this work was to characterize the virulence factors of C. tropicalis as well as to evaluate adhesion to biotic and abiotic surfaces, biofilm formation, expression of hydrolytic enzymes and antifungal susceptibility of C. tropicalis clinical isolates from urine and blood cultures and from central venous catheters. Accordingly, in order to enhance the knowledge in the process of C. tropicalis adhesion and consequent biofilm formation in urinary catheters, the first goal of this research was to develop an in vitro dynamic model, with silicone and latex urinary catheters, using artificial urine (AU). Moreover, Candida surface hydrophobicity was also evaluated, as well as the biofilm matrix content in terms of proteins and carbohydrates. So, this model using AU was shown to be suitable for studies mimicking the real body conditions. Additionally, C. tropicalis was, in fact, able to colonize both urinary catheters in the presence of AU and to detach from these catheters and move against the flow, demonstrating their ability to colonize distal sites.In vitro studies for the assessment of yeast cells adhesion capability to host tissues are essential to characterise the virulence of Candida species. However, the assessment of the number of adhered yeast cells by traditional methods is time consuming. Therefore, a simple methodology, using crystal violet staining, was developed to quantify in vitro adhesion of different Candida species to epithelial cells. The method was validated for the different Candida reference strains of different species by comparison with traditional microscope observation and enumeration. The proposed technique is easy to perform and reproducible, enabling the determination of adhesion ability of Candida species to an epithelial cell line. After standardizing the methodologies to evaluate Candida adhesion ability, the next step was the characterization of C. tropicalis virulence, by assessing antifungal susceptibility and comparing the expression of several virulence factors. Regarding adhesion, it can be highlighted that C. tropicalis strains adhered in significantly higher number to epithelium than to silicone. Furthermore, all C. tropicalis strains were able to form biofilms and to express total haemolytic activity. However, protease and phospholipase positive response were detected only in few isolates but from different sites of isolation. All isolates were susceptible to voriconazole, fluconazole and amphotericin B. Four strains were susceptible-­‐dose dependent to itraconazole and one clinical isolate was found to be resistant to this agent. Then, it was investigated the interaction of C. tropicalis with three different human cell lines: TCC-­‐SUP (epithelial cells from urinary bladder); HeLa (epithelial cells from cervical carcinoma) and Caco-­‐2 (epithelial cells from colorectal adenocarcinoma). Specifically, the degree of human cells damage and activity reduction induced by C. tropicalis adhesion and the role of Candida tropicalis aspartyl proteinases (SAPT) genes expression in this process were assessed. It was possible to observed that C. tropicalis strains were able to adhere to the different human cells, although, in a strain and cell dependent manner. Concerning human cells response to C. tropicalis, the highest cell activity inhibition was obtained for Caco-­‐2, followed by TCC-­‐SUP and HeLa cells. C. tropicalis strains in contact with the different types of epithelial cells exhibited a wide range of expression profiles of SAPT genes, however, SAPT3 was the gene expressed in a higher level. Finally, it was studied the behaviour of C. tropicalis in biofilms of different ages (24-­‐120 h) formed in artificial urine (AU) and their effect in human urinary bladder cells (TCC-­‐SUP). A similar profile in metabolic activity along biofilm age was found among strains, with an increase from 72 to 96 h and a decrease from 96 to 120 h. Candida tropicalis biofilm cells were able to adhere to TCC-­‐SUP cells, in general, independently of biofilm age. Yeasts affected TCC-­‐SUP cells, with difference among biofilms and strains. Generally, SAPT3 was highly expressed in comparison with other SAPT genes. In summary, C. tropicalis strains were able to form biofilms in AU, in static or dynamic mode, although, with differences among strains. It is important to emphasize that human cells response to C. tropicalis adhesion, as well as SAPs production, is strain and epithelial cell line dependent. Additionally, it should be highlighted that C. tropicalis cells detached from biofilms are able to colonize human cells and cause some injury and reduction of metabolic activity. Generally, SAPT3 was highly expressed compared to other SAPT genes.Candida tropicalis é uma espécie comummente relacionada com infecções nosocomiais, tais como, candidemia e candidúria. Vários fatores de virulência parecem ser responsáveis por infecções por C. tropicalis, que apresentam elevado potencial de disseminação e mortalidade. A adesão às superfícies (dispositivos médicos e células do hospedeiro) e a formação de biofilmes, são considerados factores importantes que contribuem para o desenvolvimento de candidose. Assim, a colonização do interior de cateteres urinários por C. tropicalis representa um problema crítico. Além disso, adesão e invasão das células hospedeiras por C. tropicalis é considerado o primeiro passo para iniciar infecções sistémicas. Uma vez aderidas ao epitélio, as células de C. tropicalis são capazes de excretar enzimas hidrolíticas que causam danos da membrana de células do hospedeiro. Assim, o objetivo principal deste trabalho foi caracterizar os factores de virulência de C. tropicalis, incluindo a avaliação da adesão às superfícies bióticas e abióticas, formação de biofilme, a expressão de enzimas hidrolíticas e suscetibilidade aos antifúngicos Assim, a fim de aumentar o conhecimento no processo de adesão de C. tropicalis e consequente formação de biofilme em cateteres urinários, o primeiro objetivo deste trabalho foi desenvolver um modelo dinâmico in vitro, com cateteres urinários de silicone e látex, com urina artificial (UA). Além disso, hidrofobicidade superficial de Candida também foi avaliada, assim como o conteúdo da matriz do biofilme, em termos de proteínas e hidratos de carbono. Assim, este modelo mostrou-­‐se adequado para estudos simulando as condições reais do corpo. Além disso, C. tropicalis foi, de facto, capaz de colonizar os cateteres urinários na presença de UA e destacar a partir desses cateteres e mover contra o fluxo imposto, demonstrando sua capacidade de colonizar locais mais distais. Apesar de ser fundamental desenvolver estudos in vitro para a avaliação da capacidade de adesão de leveduras aos tecidos, a avaliação do número de células de leveduras aderidas por métodos tradicionais é demorada. Assim tornou-­‐se necessário desenvolver uma metodologia simples, utilizando uma coloração com violeta cristal para quantificar a adesão in vitro de diferentes espécies de Candida a células epiteliais. O método foi validado para diferentes espécies de Candida e foi feita a comparação com a enumeração por observação ao microscópio. A técnica proposta é de fácil execução e reprodutível, permitindo a determinação da capacidade de adesão das espécies de Candida a uma linha de células epiteliais. Um outro objetivo do presente trabalho foi a caracterização da virulência de C. tropicalis, através da avaliação da susceptibilidade aos antifúngicos e comparação com a expressão de factores de virulência. Verificou-­‐se que as estirpes de C. tropicalis aderiram em número significativamente superior ao epitélio do que ao silicone, foram capazes de formar biofilmes e de manifestar atividade hemolítica total. No entanto, a protease e a fosfolipase foram detectadas apenas em alguns isolados. Todos os isolados foram susceptíveis ao voriconazol, fluconazol e anfotericina B. Quatro estirpes foram susceptíveis dose dependente ao itraconazol e um isolado clínico foi resistente a este agente. Em seguida, foi investigada a interação de C. tropicalis com três linhas celulares humanas diferentes: TCC-­‐SUP (células epiteliais da bexiga); HeLa (células epiteliais de carcinoma do colo do útero) e Caco-­‐2 (células epiteliais do adenocarcinoma colorretal). Especificamente, foram avaliados o grau de lesão das células humanas induzida por C. tropicalis e o papel da expressão do gene aspartil protease (SAPT), neste processo. Foi possível observar que as estirpes de C. tropicalis foram capazes de aderir às diferentes células humanas, embora de forma dependente da linha celular e da estirpe. Quanto à resposta de células humanas, verificou-­‐se uma maior inibição de atividade celular em Caco-­‐2, seguido de TCC-­‐SUP e HeLa. As estirpes de C. tropicalis em contato com os diferentes tipos de células epiteliais apresentaram uma ampla variedade de perfis de expressão de genes SAPT, no entanto, SAPT3 foi o gene expresso em maior quantidade. Por fim, foi estudado o efeito de biofilmes de C. tropicalis (24-­‐120 h), formados em UA, em células TCC-­‐SUP. Foi então detetado um perfil semelhante na atividade metabólica dos biofilmes das diferentes estirpes, com um aumento das 72 h para as 96 h, e uma diminuição das 96h para as 120 h. De um modo geral, as células de C. tropicalis provenientes dos biofilmes foram capazes de aderir a células TCC-­‐SUP, independentemente da idade do biofilme. As leveduras afetaram as células TCC-­‐SUP, com diferenças entre os biofilmes e as estirpes. Em geral, o gene SAPT3 foi mais expresso em comparação com outros genes SAPT. Em resumo, as estirpes de C. tropicalis estudadas foram capazes de formar biofilmes na UA, no modo estático ou dinâmico, embora com diferenças entre as estirpes. É importante ressaltar que a resposta de células humanas para à adesão C. tropicalis, bem como a produção de SAPTs, é dependente da estirpe e da linha celular. Além disso, deve-­‐se ressaltar que as células de C. tropicalis isoladas de biofilmes são capazes de colonizar as células humanas e causar alguma lesão e redução da atividade metabólica. Em geral, o gene SAPT3 foi o mais expresso

In Vitro

The roots of Cochlospermum regium, popularly known as “algodãozinho-do-cerrado,” are used for the treatment of genitourinary infections. However, the removal of their subterranean structures results in the death of the plant, and the use of the leaves becomes a viable alternative. Therefore, the antimicrobial activity of Cochlospermum regium leaf’s ethanolic extract and its action on the biofilm formation of microorganisms associated with urinary infection were evaluated. The total phenolic compounds, flavoids, and tannins were quantified using the reagents Folin-Ciocalteu, aluminum chloride, and vanillin, respectively. The antimicrobial activity was evaluated by the broth microdilution method and the effect of the extract in the biofilm treatment was measured by the drop plate method. Cytotoxicity was evaluated by the method based on the reduction of MTS and the mutagenicity by the Ames test. The ethanolic extract of C. regium leaves presented 87.4 mg/EQ of flavonoids, 167.2 mg/EAG of total phenolic compounds, and 21.7 mg/ECA of condensed tannins. It presented reduction of the biofilm formation for E. coli and C. tropicalis and antimicrobial action of 1 mg/mL and 0.5 mg/mL, respectively. The extract showed no cytotoxicity and mutagenicity at the concentrations tested. This study demonstrated that C. regium leaves are a viable option for the treatment of genitourinary infections and for the species preservation

Fatores de virulência de Candida spp isoladas de cateteres venosos e mãos de servidores hospitalares

Avaliou-se o potencial de virulência de 23 leveduras isoladas de cateteres e mãos de trabalhadores em um hospital do Noroeste do Paraná. As leveduras isoladas de cateter foram mais aderentes e hidrofóbicas (P<0,05) que as leveduras isoladas das mãos. Candida não-albicans expressaram com mais intensidade os fatores de virulência avaliados

Produção de biofilme por leveduras isoladas de cavidade bucal de usuários de prótese dentária Biofilm production by yeasts isolated from bucal cavity of prosthesis wearers

Foi analisada a presença de espécies do gênero <em>Cândida</em> na saliva de indivíduos distribuídos em três grupos: 1) com prótese e lesão; 2) com prótese sem lesão; 3) sem prótese e sem lesão, correlacionando com a capacidade de produção de biofilme em meio Sabouraud dextrose, contendo 8% de glicose, sendo determinada por leitura em espectrofotômetro. Dos 220 pacientes foram isoladas 92 leveduras: 24 (grupo 1), 24 (grupo 2) e 44 (grupo 3). Em 70% foi isolado <em>C. albicans</em> e 30% C. não <em>albicans</em>. A produção de biofilme em maior freqüência (64%) foi encontrada entre as leveduras <em>C</em>. não <em>albicans</em> e a maior porcentagem na produção de biofilme, quanto aos grupos de pacientes, foram 75, 63 e 57% correspondendo aos grupos 1, 2 e 3, respectivamente. Esses dados sugerem que a produção de biofilme das espécies do gênero <em>Cândida</em> pode estar associada ao processo infeccioso destes isolados<br>The presence of some species of <em>Candida</em> was analyzed in saliva of individuals with: 1) prostheses and lesions; 2) with prostheses without lesions; 3) without prostheses and without lesions, relating with the capacity for biofilm production in Sabouraud dextrose broth medium with 8% of glucose determinate by spectrophotometric method. A total of 92 yeasts were isolated from the 220 patients: 24 (group 1), 24 (group 2) and 44 (group 3). <em>C. albicans</em> was isolated in 70% of the cases and <em>C</em>. non <em>albicans</em> in 30%. The most frequent biofilm production (64%) was showed by <em>C</em>. non <em>albicans</em> yeasts and the patient groups who presented greater percent in biofilm production was 1, 2 and 3 corresponding to 75, 63 e 57% respectively. These data support that biofilm production may be associated with infectious process caused by <em>Candida</em> specie