Pseudopeptides and Peptidomimetics Modulating the Proteolytic Activity of Kallikrein-related Peptidase 3

The highly prostate specific serine protease kallikrein-related peptidase 3 (KLK3, also known as prostate specific antigen, PSA) is widely used as a biomarker for prostate cancer and it has also been postulated that it may play a part in tumour growth. Especially interestesting is the antiangiogenic effect exerted by proteolytically active KLK3 in cell line models. In order to stimulate the proteolytic activity of KLK3, a series of peptides have been developed by phage display methodology. Even though the peptides are quite potent KLK3 stimulators, they are not directly suitable for in vivo studies or use as drugs. Even though there are many natural and unnatural biologically active peptides, they suffer from rapid clearance via the liver and kidneys and proteolytic degradation of the compounds both in the gastrointestinal tract and other parts of the body. This gives peptides a poor oral bioavailability meaning that they are usually administered as intravenous or intramuscular injections. Several different strategies have been developed in order to access compounds with improved bioavailability including modifications of the peptide structure, development of pseudopeptides and development of small molecular weight peptidomimetics. This thesis concentrates on the further development of the two most potent peptides known to stimulate KLK3, i.e. B-2 and C-4. The main part of the work was concentrated on the replacement of disulphide bridges in the peptides in order to both gain more information on which residues are necessary for obtaining the biological activity and at the same time also gain information on how changes to the geometry of the disulphide bridge affects the activity. A series of different disulphide bridge mimicking building blocks were designed and synthesised with the intention of using them in a protocol for solid-phase synthesis of KLK3 stimulating peptides. Unfortunately, the use of these building blocks in the synthesis of pseudopeptides based on C-4 turned out to be an unsurmountable challenge and the synthesis had to be completed using a different strategy in which the key step was the use of ring-closing metathesis (RCM) for the cyclisation of the partly completed pseudopeptide. Pleasingly, the synthesis of pseudopeptide analogues of the B-2 peptide using the building blocks was more successful. In total three pseudopeptide analogues of C-4 and four of B-2 were synthesised and shown to retain the biological activity of the parent peptides. Based on the information from the synthesised pseudopeptides and a molecular modelling study, a 4-quinolone based peptidomimetic was designed to mimic the C-4 peptide and a synthetic protocol was devised to access this compound. Even though the synthesis of the desired target compound has so far not been successful, the synthetic protocol that was designed has given access to a number of 1,2,8-trisubstituted 4-quinolone derivatives.Prostatacancer är i nuläget den vanligaste formen av cancer hos män i västvärlden, så mycket som var sjätte man har uppskattats insjukna i den under sin livstid. Även om dödligheten beräknas till endast några procent innebär den stora utbredningen att prostatacancer orsakar det näst högsta antalet dödsfall i cancer hos män efter lungcancer. Pga detta är det viktigt att hitta nya metoder både för att bota prostatacancer och för att sakta ner sjukdomsförloppet. Kallikrein 3 (human kallikrein-related peptidase 3, KLK3; även känd som prostataspecifik antigen, PSA) är ett prostataspecifikt enzym som klyver proteiner och peptider (en proteas). KLK3 utsöndras i sädesvätskan och dess biologiska uppgift är att klyva de gelbildande proteiner som utsöndras vid ejakulation. Enzymatiskt aktivt KLK3 har visat sig inhibera tillväxten av blodkärl både in vitro och in vivo vilket har antagits bidra till en långsammare tumörtillväxt. En elakartad tumör i prostatan sänker utsöndringen av KLK3 i epitelvävnaden jämfört med en frisk prostata. KLK3 inverkar på tumörtillväxten i prostatacancer genom att påverka de proteolytiska kaskaderna som bryter ned den extracellulära matrisen och därmed inhibera tumörtillväxten. Substanser som gör det möjligt att modifiera den proteolytiska aktiviteten hos KLK3 är mycket intressanta för utvecklingen av nya läkemedel mot prostatacancer. En serie peptider som stimulerar den proteolytiska aktiviteten hos KLK3 har tidigare utvecklats vid Helsingfors universitet. Även om dessa peptider uppvisar en stark stimulerande effekt på KLK3 så sönderfaller de snabbt i plasma, de har också en förhållandevis stor molekylmassa för att vara peptider vilket starkt begränsar deras användbarhet in vivo. Studier har påvisat vilka delar av dessa peptider som är viktiga för den biologiska aktiviteten, utgående från denna information har vi syntetiserat serier med modifierade peptider för att vidare söka utreda vilka modifikationer som är möjliga att göra utan att den biologiska aktiviteten sjunker avsevärt. Förhoppningen är att dessa modifikationer också förbättrar peptidernas stabilitet in vitro och in vivo. De två mest aktiva av de kända peptiderna valdes ut och de naturliga disulfidbryggorna i dessa ersattes med en kolvätekedja samtidigt som andra, mindre förändringar, gjordes i övriga delar av peptiden. Vissa av peptiderna i dessa serier visade sig ha en klar biologisk aktivitet som dock var något lägre än den hos ursprungspeptiderna. En viktig slutsats av studien var att inga omfattande förändringar i peptidens struktur är möjliga. Det slutliga målet med projektet var att utveckla småmolekyler med en biologisk effekt som motsvarar den hos de ursprungliga peptiderna. Information från studierna av peptiderna och de modifierade peptiderna i kombination med datorbaserad molekylmodellering gjorde att vi valde att använda ett 1,2,8-trisubstituerat 4-kinolonskelett som grund för dessa peptidmimetika och ett syntesprotokoll för sådana substanser utvecklades. Detta syntesprotokoll visade sig vara generellt tillämpbart och användes till att syntetisera en serie 1,2,8-trisubstituerade 4-kinoloner med variation i struktur och egenskaper. De syntetiserade substanserna studeras för tillfället för sin KLK3-stimulerande effekt

A scaffold replacement approach towards new sirtuin 2 inhibitors

Sirtuins (SIRT1-SIRT7) are an evolutionary conserved family of NAD(+)-dependent protein deacylases regulating the acylation state of epsilon-N-lysine residues of proteins thereby controlling key biological processes. Numerous studies have found association of the aberrant enzymatic activity of SIRTs with various diseases like diabetes, cancer and neurodegenerative disorders. Previously, we have shown that substituted 2-alkyl-chroman-4-one/chromone derivatives can serve as selective inhibitors of SIRT2 possessing an antiproliferative effect in two human cancer cell lines. In this study, we have explored the bioisosteric replacement of the chroman-4-one/chromone core structure with different less lipophilic bicyclic scaffolds to overcome problems associated to poor physiochemical properties due to a highly lipophilic substitution pattern required for achieve a good inhibitory effect. Various new derivatives based on the quinolin-4(1H)-one scaffold, bicyclic secondary sulfonamides or saccharins were synthesized and evaluated for their SIRT inhibitory effect. Among the evaluated scaffolds, the benzothiadiazine-1,1-dioxide-based compounds showed the highest SIRT2 inhibitory activity. Molecular modeling studies gave insight into the binding mode of the new scaffold-replacement analogues.Peer reviewe

Pseudopeptides with a centrally positioned alkene-based disulphide bridge mimetic stimulate kallikrein-related peptidase 3 activity

Peer reviewe

Replacement of the Disulfide Bridge in a KLK3-Stimulating Peptide Using Orthogonally Protected Building Blocks

Peptide “B-2”, which is one of the most potent kallikrein-related peptidase 3 (KLK3)-stimulating compounds, consists of 12 amino acids and is cyclized by a disulfide bridge between the N- and C-terminal cysteines. Orthogonally protected building blocks were used in the peptide synthesis to introduce a disulfide bridge mimetic consisting of four carbon atoms. The resulting pseudopeptides with alkane and <i>E</i>-alkene linkers doubled the proteolytic activity of KLK3 at a concentration of 14 μM. They were almost as potent as the parent “B-2” peptide, which gives a 3.6-fold increase in the proteolytic activity of KLK3 at the same concentration