Genetic dissection of aroma and other fruit quality traits in melon

El meló és una espècie apreciada pel seu fruit, que presenta una gran varietat fenotípica en colors, formes, sabors i tipus de maduració. La qualitat del fruit és un dels principals objectius de la millora genètica del meló. Actualment el focus dels programes de millora està en el gust i la vida útil del fruit. La vida útil depèn del tipus de maduració, que pot ser climatèrica o no climatèrica, mentre que el gust és modulat per la quantitat de sucres i àcids, i per l'aroma. L'aroma ve determinat pels compostos orgànics volàtils, que es formen a partir d'àcids grassos, aminoàcids i terpens. Segons la seva classificació química, els aldehids aporten notes fresques i de cogombre o herba, mentre que els èsters donen dolçor i aromes afruitats. Diversos enzims involucrats en la síntesi de volàtils ja han estat identificats. No obstant això, encara existeixen molts enzims desconeguts en aquestes rutes metabòliques, i la seva relació amb la maduració està només parcialment descrita. L'objectiu d'aquesta tesi doctoral és desxifrar la genètica que hi ha darrere la producció de volàtils, i dilucidar l'efecte de diferents QTLs de maduració al perfil aromàtic del meló. Per això, s'ha analitzat l'aroma de diferents poblacions de mapeig generades a partir d'un creuament entre els cultivars 'Pell de Gripau' (no climatèric i inodor) y 'Védrantais' (climatèric i aromàtic), com una població de línies recombinants homozigotes (RILs) i dues col·leccions recíproques de línies d'introgressió (ILs). El perfil aromàtic dels fruits va ser analitzat mitjançant cromatografia de gasos i espectrometria de masses (GC-MS) per identificar QTLs associats a volàtils. A la població de RILs es van identificar 166 QTLs formant grups a regions específiques del genoma. El cromosoma 8 es va revelar com un important centre regulador de l'aroma i la maduració. Per altra banda, a les col·leccions d'ILs es van detectar més de 1000 QTLs. Diversos QTLs van ser mapejats a les mateixes regions en més d'una població, validant així el nostre anàlisi. Es van trobar regions als cromosomes 3, 6, 7 i 8 relacionant aroma i maduració. No obstant això, també es van detectar QTLs d'aroma independents de la maduració. Es van seleccionar dues regions d'interès als cromosomes 6 i 11 per dur a terme un mapeig fi. Al cromosoma 6, dues enoil-CoA isomerases 2 han sigut seleccionades com candidates per a la degradació de volàtils monoinsaturats derivats de lípids. Per altra banda, al cromosoma 11 es van revelar 3 sub-QTLs a la regió d'estudi, fet que emfatitza la complexa regulació de la formació de volàtils. Alguns del gens candidats estan relacionats amb el metabolisme primari, mentre que d'altres son factors de transcripció. A més, es va intentar fer la validació funcional d'una aldehid oxidasa del cromosoma 5, i els resultats preliminars van mostrar la seva associació amb la conversió de benzaldehid en àcid benzoic. D'altra banda, un projecte secundari va consistir en validar mitjançant l'ús de CRISPR/Cas9 la funció de CmOFP13 a meló, un gen reportat com modulador de la forma del fruit, i ja validat en arabidopsis. En aquest assaig es van aconseguir plantes de meló mutants diploides heterozigotes per l'edició a partir de plantes tetraploides, i es va observar un allargament del fruit a l'eix vertical. En resum, la present tesi incrementa la llista de regions genòmiques involucrades a la producció de volàtils, establint la base per a futurs treballs de mapeig genòmic per la millora de l'aroma en meló. A més, el gens identificats podran ser validats en treballs posteriors. El coneixement generat en aquesta tesi contribuirà a la millora de la qualitat del meló i podrà ser transferit als programes de millora.El melón es una especie apreciada por su fruto, que presenta una gran variedad fenotípica en colores, formas, sabores y tipos de maduración. La calidad del fruto es uno de los principales objetivos de la mejora genética del melón. Actualmente el foco está puesto en mejorar el sabor y la vida útil del fruto. La vida útil depende del tipo de maduración, que puede ser climatérica o no climatérica, mientras que el sabor es modulado por la cantidad de azúcares y ácidos, y por el aroma. El aroma viene dado por los compuestos orgánicos volátiles, que se forman a partir de ácidos grasos, aminoácidos y terpenos. Según su clasificación química, los aldehídos suelen aportar notas frescas y apepinadas o herbales, mientras que los ésteres dan dulzor y aromas frutales. Varias enzimas involucradas en la síntesis de compuestos volátiles han sido ya identificadas, sin embargo, todavía existen muchas enzimas desconocidas en estas rutas metabólicas, y su relación con la maduración solo está parcialmente descrita. El objetivo de esta tesis doctoral es diseccionar la genética detrás de la producción de volátiles, y dilucidar el efecto de diferentes QTLs de maduración en el perfil aromático del melón. Para ello, se ha analizado el aroma de distintas poblaciones de mapeo generadas mediante un cruce entre los cultivares 'Piel de Sapo' (no climatérico e inodoro) y 'Védrantais' (climatérico y aromático), entre ellas una población de líneas recombinantes homocigotas (RILs) y dos colecciones recíprocas de líneas de introgresión (ILs). El perfil aromático de los frutos fue analizado mediante cromatografía de gases y espectrometría de masas (GC-MS) en busca de QTLs asociados a volátiles. En la población de RILs se identificaron 166 QTLs formando grupos en regiones específicas del genoma. El cromosoma 8 se reveló como un importante centro regulador del aroma y la maduración. Por otra parte, en las colecciones de ILs se detectaron más de 1000 QTLs. Varios QTLs fueron mapeados en las mismas regiones en más de una población, validando así nuestro análisis. Se encontraron regiones en los cromosomas 3, 6, 7 y 8 relacionando aroma y maduración, sin embargo, también se detectaron QTLs de aroma independientes de la maduración. Se seleccionaron dos regiones de interés en los cromosomas 6 y 11 para realizar un mapeo fino. En el cromosoma 6 dos enoil-CoA isomerasas 2 han sido seleccionadas como candidatas para la degradación de volátiles monoinsaturados derivados de lípidos. Por otra parte, en el cromosoma 11 se revelaron 3 sub-QTLs en la región de estudio, lo que enfatiza la compleja regulación de la formación de volátiles. Algunos genes candidatos propuestos están relacionados con el metabolismo primario, mientras que otros son factores de transcripción. Además de ello, se intentó la validación funcional de una aldehído oxidasa del cromosoma 5, y los resultados preliminares mostraron una asociación con la conversión de benzaldehído en ácido benzoico. Por otra parte, un proyecto secundario consistió en validar mediante el uso de CRISPR/Cas9 la función de CmOFP13 en melón, un gen reportado como modulador de la forma del fruto y ya validado en arabidopsis. En este ensayo se consiguieron plantas de melón mutantes diploides heterocigotas para la edición a partir de plantas tetraploides, y se observó un alargamiento del fruto en el eje vertical. En resumen, la presente tesis incrementa la lista de regiones genómicas involucradas en la producción de volátiles, estableciendo la base para futuros trabajos de mapeo génico para la mejora del aroma en melón. Además, los genes identificados podrán ser validados en trabajos posteriores. El conocimiento generado en esta tesis contribuirá a la mejora de la calidad del melón y podrá ser transferido a programas de mejora.Melon is a valuable species mainly appreciated by its fruit. Melon fruit has a great phenotypic diversity, presenting different colors, shapes, flavor and ripening behavior. Fruit quality is a main concern for melon breeding. The focus is currently on improving flavor and shelf life. Shelf life generally depends on the fruit ripening behavior, which can be climacteric or non-climacteric, whereas flavor is influenced by sugar and acids accumulation, and aroma. Aroma is formed by volatile organic compounds (VOCs), which can be synthesized from fatty acids, aminoacids and terpenes. Within VOCs, aldehydes usually give green notes, while esters are generally fruity and sweet. Although some enzymes involved in VOCs biosynthesis have been already reported, there are still many unknown enzymes working on VOCs metabolic pathways, and their relationship with ripening is only partially known. The objective of this doctoral thesis is to dissect the genetics behind VOCs production, and the effect of different ripening QTLs in the volatile profile. For that reason, mapping populations generated from a cross between the non-climacteric non-aromatic 'Piel de Sapo' cultivar and the climacteric aromatic 'Védrantais' cultivar were analyzed in search for QTLs associated to aroma. A Recombinant Inbred Lines (RILs) population and two reciprocal Introgression Line (IL) collections were analyzed by Gas Chromatography-Mass Spectrometry (GC-MS). In the RILs population, 166 QTLs were identified, and several of them formed clusters in specific genomic regions. Chromosome 8 was highlighted as a main player in both ripening and aroma regulation. On the other hand, more than 1,000 QTLs were detected in the two IL collections. Several QTLs were found in the same regions in more than one population, validating our analysis. Regions on chromosomes 3, 6, 7 and 8 were found to link ripening and aroma. However, ripening-independent aroma QTLs were also identified. Two interesting regions on chromosomes 6 and 11 were selected for fine mapping. On chromosome 6, two enoyl-CoA isomerases 2 are candidates for the degradation of 3Z-monounsaturated lipid-derived VOCs. On chromosome 11, a complex regulation of ester formation was revealed, finding 3 sub-QTLs in the region of study, with some candidate genes related to the primary metabolism. In addition, a functional validation of an aldehyde oxidase on chromosome 5 was attempted. The preliminary results showed that this enzyme is putatively involved in benzaldehyde conversion into benzoic acid. A secondary project involved the use of CRISPR-Cas9 to validate the effect of CmOFP13 in melon. This gene was reported to modulate fruit shape and had been successfully validated in Arabidopsis. In this study, diploid edited heterozygous melon plants were obtained, producing the expected phenotype: more elongated fruits. Overall, the present thesis has shed light on the many genomic regions responsible for VOCs production, establishing the basis for future fine mapping works. Several candidate genes have also been proposed, opening the door for further validation assays. The knowledge contained in this thesis will contribute to improve melon fruit quality and will be transferred to breeding programs.Universitat Autònoma de Barcelona. Programa de Doctorat en Biologia i Biotecnologia Vegeta

Genetic dissection of aroma and other fruit quality traits in melon

El meló és una espècie apreciada pel seu fruit, que presenta una gran varietat fenotípica en colors, formes, sabors i tipus de maduració. La qualitat del fruit és un dels principals objectius de la millora genètica del meló. Actualment el focus dels programes de millora està en el gust i la vida útil del fruit. La vida útil depèn del tipus de maduració, que pot ser climatèrica o no climatèrica, mentre que el gust és modulat per la quantitat de sucres i àcids, i per l'aroma. L'aroma ve determinat pels compostos orgànics volàtils, que es formen a partir d'àcids grassos, aminoàcids i terpens. Segons la seva classificació química, els aldehids aporten notes fresques i de cogombre o herba, mentre que els èsters donen dolçor i aromes afruitats. Diversos enzims involucrats en la síntesi de volàtils ja han estat identificats. No obstant això, encara existeixen molts enzims desconeguts en aquestes rutes metabòliques, i la seva relació amb la maduració està només parcialment descrita. L'objectiu d'aquesta tesi doctoral és desxifrar la genètica que hi ha darrere la producció de volàtils, i dilucidar l'efecte de diferents QTLs de maduració al perfil aromàtic del meló. Per això, s'ha analitzat l'aroma de diferents poblacions de mapeig generades a partir d'un creuament entre els cultivars 'Pell de Gripau' (no climatèric i inodor) y 'Védrantais' (climatèric i aromàtic), com una població de línies recombinants homozigotes (RILs) i dues col·leccions recíproques de línies d'introgressió (ILs). El perfil aromàtic dels fruits va ser analitzat mitjançant cromatografia de gasos i espectrometria de masses (GC-MS) per identificar QTLs associats a volàtils. A la població de RILs es van identificar 166 QTLs formant grups a regions específiques del genoma. El cromosoma 8 es va revelar com un important centre regulador de l'aroma i la maduració. Per altra banda, a les col·leccions d'ILs es van detectar més de 1000 QTLs. Diversos QTLs van ser mapejats a les mateixes regions en més d'una població, validant així el nostre anàlisi. Es van trobar regions als cromosomes 3, 6, 7 i 8 relacionant aroma i maduració. No obstant això, també es van detectar QTLs d'aroma independents de la maduració. Es van seleccionar dues regions d'interès als cromosomes 6 i 11 per dur a terme un mapeig fi. Al cromosoma 6, dues enoil-CoA isomerases 2 han sigut seleccionades com candidates per a la degradació de volàtils monoinsaturats derivats de lípids. Per altra banda, al cromosoma 11 es van revelar 3 sub-QTLs a la regió d'estudi, fet que emfatitza la complexa regulació de la formació de volàtils. Alguns del gens candidats estan relacionats amb el metabolisme primari, mentre que d'altres son factors de transcripció. A més, es va intentar fer la validació funcional d'una aldehid oxidasa del cromosoma 5, i els resultats preliminars van mostrar la seva associació amb la conversió de benzaldehid en àcid benzoic. D'altra banda, un projecte secundari va consistir en validar mitjançant l'ús de CRISPR/Cas9 la funció de CmOFP13 a meló, un gen reportat com modulador de la forma del fruit, i ja validat en arabidopsis. En aquest assaig es van aconseguir plantes de meló mutants diploides heterozigotes per l'edició a partir de plantes tetraploides, i es va observar un allargament del fruit a l'eix vertical. En resum, la present tesi incrementa la llista de regions genòmiques involucrades a la producció de volàtils, establint la base per a futurs treballs de mapeig genòmic per la millora de l'aroma en meló. A més, el gens identificats podran ser validats en treballs posteriors. El coneixement generat en aquesta tesi contribuirà a la millora de la qualitat del meló i podrà ser transferit als programes de millora.El melón es una especie apreciada por su fruto, que presenta una gran variedad fenotípica en colores, formas, sabores y tipos de maduración. La calidad del fruto es uno de los principales objetivos de la mejora genética del melón. Actualmente el foco está puesto en mejorar el sabor y la vida útil del fruto. La vida útil depende del tipo de maduración, que puede ser climatérica o no climatérica, mientras que el sabor es modulado por la cantidad de azúcares y ácidos, y por el aroma. El aroma viene dado por los compuestos orgánicos volátiles, que se forman a partir de ácidos grasos, aminoácidos y terpenos. Según su clasificación química, los aldehídos suelen aportar notas frescas y apepinadas o herbales, mientras que los ésteres dan dulzor y aromas frutales. Varias enzimas involucradas en la síntesis de compuestos volátiles han sido ya identificadas, sin embargo, todavía existen muchas enzimas desconocidas en estas rutas metabólicas, y su relación con la maduración solo está parcialmente descrita. El objetivo de esta tesis doctoral es diseccionar la genética detrás de la producción de volátiles, y dilucidar el efecto de diferentes QTLs de maduración en el perfil aromático del melón. Para ello, se ha analizado el aroma de distintas poblaciones de mapeo generadas mediante un cruce entre los cultivares 'Piel de Sapo' (no climatérico e inodoro) y 'Védrantais' (climatérico y aromático), entre ellas una población de líneas recombinantes homocigotas (RILs) y dos colecciones recíprocas de líneas de introgresión (ILs). El perfil aromático de los frutos fue analizado mediante cromatografía de gases y espectrometría de masas (GC-MS) en busca de QTLs asociados a volátiles. En la población de RILs se identificaron 166 QTLs formando grupos en regiones específicas del genoma. El cromosoma 8 se reveló como un importante centro regulador del aroma y la maduración. Por otra parte, en las colecciones de ILs se detectaron más de 1000 QTLs. Varios QTLs fueron mapeados en las mismas regiones en más de una población, validando así nuestro análisis. Se encontraron regiones en los cromosomas 3, 6, 7 y 8 relacionando aroma y maduración, sin embargo, también se detectaron QTLs de aroma independientes de la maduración. Se seleccionaron dos regiones de interés en los cromosomas 6 y 11 para realizar un mapeo fino. En el cromosoma 6 dos enoil-CoA isomerasas 2 han sido seleccionadas como candidatas para la degradación de volátiles monoinsaturados derivados de lípidos. Por otra parte, en el cromosoma 11 se revelaron 3 sub-QTLs en la región de estudio, lo que enfatiza la compleja regulación de la formación de volátiles. Algunos genes candidatos propuestos están relacionados con el metabolismo primario, mientras que otros son factores de transcripción. Además de ello, se intentó la validación funcional de una aldehído oxidasa del cromosoma 5, y los resultados preliminares mostraron una asociación con la conversión de benzaldehído en ácido benzoico. Por otra parte, un proyecto secundario consistió en validar mediante el uso de CRISPR/Cas9 la función de CmOFP13 en melón, un gen reportado como modulador de la forma del fruto y ya validado en arabidopsis. En este ensayo se consiguieron plantas de melón mutantes diploides heterocigotas para la edición a partir de plantas tetraploides, y se observó un alargamiento del fruto en el eje vertical. En resumen, la presente tesis incrementa la lista de regiones genómicas involucradas en la producción de volátiles, estableciendo la base para futuros trabajos de mapeo génico para la mejora del aroma en melón. Además, los genes identificados podrán ser validados en trabajos posteriores. El conocimiento generado en esta tesis contribuirá a la mejora de la calidad del melón y podrá ser transferido a programas de mejora.Melon is a valuable species mainly appreciated by its fruit. Melon fruit has a great phenotypic diversity, presenting different colors, shapes, flavor and ripening behavior. Fruit quality is a main concern for melon breeding. The focus is currently on improving flavor and shelf life. Shelf life generally depends on the fruit ripening behavior, which can be climacteric or non-climacteric, whereas flavor is influenced by sugar and acids accumulation, and aroma. Aroma is formed by volatile organic compounds (VOCs), which can be synthesized from fatty acids, aminoacids and terpenes. Within VOCs, aldehydes usually give green notes, while esters are generally fruity and sweet. Although some enzymes involved in VOCs biosynthesis have been already reported, there are still many unknown enzymes working on VOCs metabolic pathways, and their relationship with ripening is only partially known. The objective of this doctoral thesis is to dissect the genetics behind VOCs production, and the effect of different ripening QTLs in the volatile profile. For that reason, mapping populations generated from a cross between the non-climacteric non-aromatic 'Piel de Sapo' cultivar and the climacteric aromatic 'Védrantais' cultivar were analyzed in search for QTLs associated to aroma. A Recombinant Inbred Lines (RILs) population and two reciprocal Introgression Line (IL) collections were analyzed by Gas Chromatography-Mass Spectrometry (GC-MS). In the RILs population, 166 QTLs were identified, and several of them formed clusters in specific genomic regions. Chromosome 8 was highlighted as a main player in both ripening and aroma regulation. On the other hand, more than 1,000 QTLs were detected in the two IL collections. Several QTLs were found in the same regions in more than one population, validating our analysis. Regions on chromosomes 3, 6, 7 and 8 were found to link ripening and aroma. However, ripening-independent aroma QTLs were also identified. Two interesting regions on chromosomes 6 and 11 were selected for fine mapping. On chromosome 6, two enoyl-CoA isomerases 2 are candidates for the degradation of 3Z-monounsaturated lipid-derived VOCs. On chromosome 11, a complex regulation of ester formation was revealed, finding 3 sub-QTLs in the region of study, with some candidate genes related to the primary metabolism. In addition, a functional validation of an aldehyde oxidase on chromosome 5 was attempted. The preliminary results showed that this enzyme is putatively involved in benzaldehyde conversion into benzoic acid. A secondary project involved the use of CRISPR-Cas9 to validate the effect of CmOFP13 in melon. This gene was reported to modulate fruit shape and had been successfully validated in Arabidopsis. In this study, diploid edited heterozygous melon plants were obtained, producing the expected phenotype: more elongated fruits. Overall, the present thesis has shed light on the many genomic regions responsible for VOCs production, establishing the basis for future fine mapping works. Several candidate genes have also been proposed, opening the door for further validation assays. The knowledge contained in this thesis will contribute to improve melon fruit quality and will be transferred to breeding programs