Uso de marcadores genéticos de ADN para la caracterización de razas de camélidos sudamericanos domésticos

Publicación a texto completo no autorizada por el autorEvalúa un panel de marcadores genéticos de tipo microsatélite en muestras de ADN de los cuatro tipos de camélidos sudamericanos; alpacas, llamas, vicuñas y guanacos. Así mismo se busca conocer la estructura poblacional de alpacas y llamas y su relación con la vicuña y guanaco (especies silvestres). Para ello se evalúa un panel de 11 marcadores microsatélites y un marcador mitocondrial. Del análisis se confirma la existencia de sólo dos haplotipos para los camélidos sudamericanos (I y II) y la presencia de alpacas y llamas híbridas entre ellas. Además, se confirma las relaciones genéticas entre alpacas con vicuñas y llamas con guanacos, contribuyendo a entender el origen de los camélidos domésticos. Los marcadores microsatélite evaluados permiten confirmar que los dos fenotípos de alpacas (huacaya y suri) constituyen un solo grupo genético y que los dos tipos de llamas evaluadas (Q´ara y ch´aku) son genéticamente distintas. Finalmente los análisis desarrollados permiten identificar alpacas y llamas híbridas, animales que podrían poner en riesgo la conservación de nuestros recursos genéticos animales.Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (Perú) Universidad Nacional Mayor de San Marcos (Lima). Vicerrectorado de Investigación y PosgradoTesi

Molecular genotyping and subtyping of Clostridium perfringens isolated from fatal enterotoxemia in alpacas

A pesar de que la enterotoxemia causada por el Clostridium perfringens ocasiona elevadas tasas de mortalidad neonatal en alpacas, muy poco se conoce acerca de las toxinas que participan en la patogénesis de la enfermedad. El presente estudio reporta resultados de análisis moleculares de 47 cepas de C. perfringens aislados de casos mortales de enterotoxemia en alpacas, basados en la amplificación de los genes cpa, cpb, etx y iap codificantes de las toxinas α, β, g, e (genotipificación), así como la detección de genes secundarios codificantes de la enterotoxina (cpe) y toxina β2 (subtipificación). El ADN bacteriano de las 47 cepas fue sometido a prueba de PCR múltiple evidenciando que 46/47 (97.9%) de los aislamientos correspondieron al genotipo A y de estos, 13/46 (28.3%) contenían adicionalmente el gen β2 (subtipo cpe-vocpb2+vo), mientras que las restantes 33 muestras (71.7%) fueron negativas para ambos genes secundarios (subtipo cpe-vocpb2-vo). Solo una de las 47 (2.1%) muestras correspondió al genotipo C y positivo al gen CPE (subtipo cpe+vocpb2-vo). Estos resultados sugieren la posible participación de la toxina alfa y beta2 en los casos de enterotoxemia de las alpacas, pero excluyen a la enterotoxina.Although enterotoxemia produced by Clostridium perfringens causes elevated neonatal mortality in the alpaca, scarce information exists on the virulence factors (toxins) which play an important role in the pathogenesis of the disease. The objective of this study was to genotype and subtype C. perfringens isolates from enterotoxemia induced mortalities based on the presence of genes cpa, cpb, etx and iap which encode the toxins α, β, g, and , and the genes cpe and cpb2 which encode the enterotoxin (cpe) and β2-toxins, respectively. A total of 47 C. perfringens isolates were obtained from the small intestine of neonatal alpaca mortalities which presented clinical signs, as well as gross and histological injuries typical of enterotoxemia. The results showed that 46/47 (97.9%) of the isolates were genotype A, 13 of these 46 (28.3%) also had cpb2 (genotype A, subtype cpe-cpb2+), while the remaining 33 (71.3%) were negative for both cpe and cpb2 genes (genotype A, subtype cpe-cpb2 -) and only 1/47 (2.1%) had the cpa, cpb y cpe genes (genotype C, subtype cpe+cpb2-). The results indicate that both the alpha and beta2 toxins likely play an important role in enterotoxemia aetiology, but excluded participation of the enterotoxin

Molecular sexing from stools in spectacled bear (Tremarctos ornatus)

El oso de anteojos (Tremarctos ornatus) se encuentra vulnerable debido a la caza y destrucción de su medio ambiente y es de difícil observación en vida libre, lo que obstaculiza su manejo e investigación, por lo que el uso de muestras no invasivas como heces se convierte en una gran herramienta. El objetivo del presente estudio fue adaptar una técnica de sexado mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de ADN extraído de células exfoliadas del colon presentes en muestras de heces. Se utilizaron 17 muestras (10 de hembras y 7 de machos) de osos de sexo conocido y criados en cautiverio en cuatro instituciones de la zona de Lima, Perú. Para la extracción de ADN se utilizó un kit comercial específico para heces. Se logró extraer de 20 a 30 ng de ADN de cada muestra. Mediante PCR se evaluaron dos secuencias de genes: amelogenina con los cebadores SE47-SE48 y la región determinante del sexo en el cromosoma Y (SRY) con los cebadores SRYB3- SRYB5. Con el gen de amelogenina se logró sexar a los 17 osos (100%), mientras que con el gen SRY no se logró el sexado. Se concluye que con el gen amelogenina hay una coincidencia de 100% entre el sexo conocido y el sexo hallado mediante PCR de ADN extraído de heces.The spectacled bear (Tremarctos ornatus) is a vulnerable species because of hunting and destruction of its environment. Also, it is difficult to monitor in the wild hampering the management and research efforts and therefore, the use of non-invasive samples such as faeces becomes a useful tool. The aim of this study was to develop a technique for sexing by the Polymerase Chain Reaction (PCR) using DNA extracted from exfoliated colon cells present in faecal samples. Seventeen samples (from 10 females and 7 males) were collected from bears of known sex reared in captivity in four institutions in Lima Peru. DNA extraction was done by using a specific kit for faecal samples. The concentration of extracted DNA varied between 20 to 30 ng. Using PCR, two gene sequences were evaluated: amelogenin with primers SE47-SE48 and sex-determining region in the Y chromosome (SRY) with primers SRYB5-SRYB3. Sex determination by the amelogenin gene was achieved in all bears (100%), whereas failed in all samples when using the SRY gene primers. It is concluded that there is 100% match with the amelogenin gene between the known and detected sex using the PCR of DNA extracted from faeces

Reporte de Adenocarcinoma Pulmonar Ovino en un Cordero de Cinco Meses de Edad en Puno, Perú

A case of ovine pulmonary adenocarcinoma is reported in a five month-old indigenous lamb of the department of Puno, Peru. At clinical inspection, the animal presented dyspnea, body weight loss and abundant lung secretion. The necropsy revealed in both diaphragmatic lobes the presence of two grayish white nodular formations with plenty of white foamy fluid emanating from the trachea. At the cut surface of the tumor was observed irregular micronodules with a tendency to coalesce. Histologically, the tumors were composed of columnar or cuboidal cells isolated by a fibrotic stroma and surrounded by alveoli flooded with macrophages of vacuolar cytoplasm. Intraluminal polyps were observed in the terminal bronchioles compromising the bronchiolar epithelium. Molecular analysis of lung tissue and fluid contained the exogenous genetic sequences of type D retrovirus. Retroviral infection with multi nodular presence of neoplastic lesions in a lamb corroborates the susceptibility of indigenous Andean sheep to retroviral infection.Se reporta un caso de adenocarcinoma pulmonar ovino en un cordero criollo de cinco meses de edad, procedente del departamento de Puno, Perú. El animal, a la inspección clínica, presentó disnea, pérdida de peso y abundante secreción pulmonar. A la necropsia se observaron formaciones nodulares blanco grisáceas en los lóbulos diafragmáticos y abundante fluido espumoso blanquecino en la tráquea. En la superficie de corte de los tumores se visualizaron numerosos micronódulos de contorno irregular con tendencia a la coalescencia. Histológicamente, las formaciones tumorales, compuestas por células columnares o cuboidales, se mostraron aisladas por un estroma fibrosado y rodeadas por alveolos inundados de macrófagos con citoplasma vacuolar. En los bronquios terminales se observaron pólipos intraluminales comprometiendo el epitelio bronquiolar. El análisis molecular del fluido y tejido pulmonar contenían secuencias genéticas del retrovirus exógeno del Tipo D productor de la enfermedad. La infección retroviral con presencia multinodular de lesiones neoplásicas en un cordero corrobora la susceptibilidad de ovinos criollos a la infección retroviral

Los buitres, aves carroñeras del Viejo Mundo y Nuevo Mundo

This paper reviews the existing information on the group of birds known as vultures, birds specialized in ingesting carrion, distributed in almost all continents and with similar physical characteristics and behaviors. The objective of the review is to present the global problems and threats to which this group of birds is subjected, mainly due to the anthropic effect, loss of their natural habitat, lead poisoning, and provoked or accidental poisoning, among other factors, that have caused their disappearance in various countries and have placed them on the brink of extinction. The current state of conservation and main threats of the two large groups, vultures of the Old and New World, are reviewed.El presente artículo revisa la información existente sobre el grupo de aves denominado buitres, aves especializadas en la ingestión de carroña, distribuidas en casi todos los continentes y que tienen características físicas y comportamientos similares. El objetivo de la revisión es dar a conocer la problemática mundial y amenazas a las que es sometido este grupo de aves, principalmente por el efecto antrópico, pérdida de su hábitat natural, intoxicación por plomo, y envenenamiento provocado o accidental, entre otros factores, que han causado su desaparición en diversos países y los han colocado al borde de la extinción. Se revisa el estado actual de conservación y principales amenazas de los dos grandes grupos, buitres del Viejo y del Nuevo Mundo

Whole-genome analysis of Mannheimia haemolytica serotype A2 to identify potential vaccine candidates against acute pneumonia in alpacas

El objetivo del presente trabajo fue identificar antígenos inmunoprotectivos en la secuencia genómica de Mannheimia haemolytica serotipo A2 Ovino, aislado de ovino y disponible en las bases de datos, que puedan ser utilizados como potenciales candidatos vacunales contra la neumonía en alpacas. Para ello, se empleó la secuencia completa del genoma de este microorganismo disponible en las bases de datos y mediante el uso de herramientas bioinformáticas se procedió a la búsqueda e identificación de genes candidatos, la anotación funcional, la predicción de la localización subcelular y la identificación de motivos de secuencias, incluyendo dominios transmembrana, peptidos señal de secreción y lipoproteínas. Los factores de virulencia fueron identificados en la base de datos de factores de virulencia (VFDB) y en la base de datos microbiana de virulencia (MvirDB). Los criterios de selección incluyeron proteínas conservadas, secretadas y asociadas a superficie con hélices transmembrana d»1. Se realizó la búsqueda de homología de genes con la base de datos de antígenos protectivos (Protegen), permitiendo la identificación de 23 antígenos potencialmente inmunoprotectivos, conservados entre los serotipos virulentos de M. haemolytica y otros patógenos de la familia Pasteurellaceae. Los genes identificados están relacionados con la patogénesis, virulencia y evasión del sistema immune del hospedero y podrían ser grandes candidatos a ser evaluados como potenciales vacunas contra la pasteurelosis neumónica.The aim of this study was to identify immunoprotective antigens in the genomic sequence of Mannheimia haemolytica serotype A2 isolated from sheep and available in databases that can be used as potential vaccine candidates against pneumonia in alpacas. To do this, the complete genome sequence of this organism available in databases was used and by using bioinformatics tools was proceeded to search for and identification of candidate genes, functional annotation, predicting the subcellular localization and identification of sequence motifs including transmembrane domains, secretion signal peptides and lipoproteins. Virulence factors were identified in the database of virulence factors (VFDB) and the microbial database of virulence factors (MvirDB). Selection criteria included conserved proteins, secreted and associated surface with transmembrane helices <1. Homology search of genes was performed with the database of protective antigens (Protegen), allowing the identification of 23 potentially immunoprotective antigens conserved between virulent M. haemolytica serotypes and other pathogens of the family Pasteurellaceae. The genes identified are related to the pathogenesis, virulence and immune system evasion of the host and they could be great candidates to be evaluated as potential vaccines against pneumonic pasteurellosis

SEX DETERMINATION BY ADN IN FIVE MACAW SPECIES

La determinación del sexo en aves de especies silvestres es de vital importancia para tomar medidas de conservación. En especies donde no existe dimorfismo sexual, es necesario contar con una prueba de sexaje alternativo a los métodos quirúrgicos. En este sentido, con la finalidad de estandarizar una prueba para la determinación del sexo en guacamayos, se desarrolló y evaluó una prueba molecular que consistió en el análisis de ADN mediante la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR). Para ello, se procedió a la extracción de ADN a partir de muestras de sangre cinco especies de guacamayos (Ara ararauna, Ara chloroptera, Ara macao, Ara militaris y Propyrrhura couloni). A través de la técnica de PCR y el uso de primers específicos, se amplificó regiones conservadas (exones) y secuencias de regiones no conservadas (intrones) del gen chd (Chromodomainhelicase- DNA-binding protein), presentes en ambos cromosomas sexuales (Z y W), que permiten diferenciar hembras (chd-ZW) de machos (chd-ZZ). Para la amplificación, se optimizaron las condiciones y los ciclos de PCR. Se pudo detectar dos fragmentos entre 300-400 pares de bases en aves hembras y solamente uno en especies machos. Se observó 100% (31/31) de correspondencia entre el sexaje por métodos convencionales y por análisis de ADN. La prueba molecular fue posteriormente utilizada para sexar a 28 guacamayos de sexo desconocido, incluyendo 11 aves de la especie peruana Propyrrhura couloni.Determination of sex in wild birds is crucial in developing conservation plans for threatened species. The absence of sexual dimorphism in birds makes impossible to determine sex based on physical characteristics and sexing has traditionally depended upon surgical methods which are highly stressful for the animals. The present study had the purpose of developing of a noninvasive DNA test for sex determination in macaws (guacamayos). Blood samples from five species (Ara ararauna, Ara chloroptera, Ara macao, Ara militaris y Propyrrhura couloni) were studied. DNA was extracted and specific primers were used to amplify both exons and introns of the chd (chromo-helicase- DNA-binding) gene located on the sex chromosomes of all birds. Females are identified by chd-ZW on the W chromosome and males by chd-ZZ on the Z chromosome. The amplification was carried out by the optimization of the conditions and the PCR cycles. Two fragments of 300-400 bp were detected in female birds and one in males. Sex determined by conventional methods in 31 birds agreed with DNA results. The molecular test was also used to sex 28 macaws of unknown sex, including 11 Propyrrhura couloni

Genotypes of kappa-casein gen in creole cattle of Bambamarca district (Cajamarca, Peru)

El presente estudio tuvo como objetivo determinar la frecuencia alélica y genotípica del gen kappa-caseína (κ-CN) en ganado bovino criollo. Se recolectaron 48 muestras de sangre de bovinos de nueve centros poblados del distrito de Bambamarca (Cajamarca, Perú). Se extrajo el ADN y la genotipificación se realizó mediante análisis de RFLP-PCR del gen κ-CN. Las frecuencias genotípicas encontradas fueron de 0.56, 0.27 y 0.17 para los genotipos AB, AA y BB, respectivamente, en tanto que las frecuencias alélicas resultaron ser de 0.552 y 0.448 para los alelos A y B, respectivamente. Se concluye que los animales evaluados presentan una baja proporción de individuos con el genotipo deseado BB, genotipo que favorece la producción de queso.The aim of this study was to determine the allelic and genotypic frequency of kappacasein gene (κ-CN) in creole cattle. For this purpose, 48 blood samples were collected from animals in nine villages of the Bambamarca district, Cajamarca, Peru. DNA was extracted and genotyping was performed by PCR-RFLP analysis of κ-CN gene. Genotype frequencies of 0.56, 0.27 and 0.17 for the AB, AA and BB genotypes were found, while the allele frequencies were 0.552 and 0.448 for alleles A and B respectively. It was concluded that the tested group had a low proportion of individuals with the desired BB genotype that favors the production of cheese

Use of polimerase chain reaction for sexing south american camelids

Se reporta el desarrollo y optimizaciones de técnicas moleculares (PCR simple, múltiple y semi-anidada) para determinar el sexo de camélidos sudamericanos (CSA) amplificando la secuencia del gen Zinc Finger Protein (ZF). La técnica utilizó ADN obtenido de 28 muestras de sangre de alpacas, llamas y vicuñas, 20 muestras de heces de vicuñas y guanacos conservadas en etanol al 96%, y 22 embriones de alpaca colectados entre 72 y 96 horas postmonta y preservados en etanol. Las muestras de ADN de sangre y heces fueron extraídas usando kits comerciales, y las de embriones aplicando tres métodos (ebullición, proteinasa K y fenol-cloroformo). Una vez optimizada la PCR simple para la detección de los genes ZFY y ZFX, se implementó la PCR múltiple para ADN de sangre y heces y la PCR semi-anidada para ADN de embriones. La técnica de PCR múltiple determinó el sexo correctamente en el 100% de las muestras de ADN sanguíneo, en el 87.5% de muestras de ADN de heces colectadas en 2008 y en el 50% de las muestras de ADN de heces colectadas en 2004 y preservadas durante cuatro años antes del análisis. La prueba de PCR semi-anidada, sin embargo, no pudo ser optimizada.The objective of this study was to develop a PCR technique to determine the sex of South American camelids (CSA) using Zinc Finger Protein (ZF) sequences from blood and fecal samples, as well as cells from alpaca embryos. A total of 28 alpaca, llama and vicuña blood samples, 20 vicuña and guanaco fecal samples, and 22 alpaca embryos collected between 72 and 96 hours postcopula were used. The fecal and embryo samples were preserved in 96% and 70% ethanol respectively. DNA was extracted from blood and feces using commercial kits. Three methods (boiling, proteinase K and phenol-cloroform) were used to extract DNA from alpaca embryos. Two PCR techniques were developed to analyze DNA: multiplex (for fecal and blood sample DNA) and heminested PCR (for embryo cell DNA). The multiplex PCR accurately determined the sex in 100% of the DNA samples extracted from blood, in 87.5% of the samples extracted from fresh feces and in 50% of the 4-year old fecal samples. The heminested PCR, however, could not be optimized

Detección del Gen PrP de Scrapie en Ovinos Junín

The aim of this study was to establish the frequency of resistance and susceptible genotypes to scrapie in the Junin sheep breed. For this, 56 blood samples were collected in a sheep farm in the central highlands of Peru. The DNA was extracted and the PCR products were analyzed by enzymatic digestion using restriction endonucleases that recognize the PrP gene polymorphisms. Four of the 5 haplotypes reported for the PrP gene were identified: ARR (48.2%), ARQ (35.7%), AHQ (10.7%) and VRQ (5.4%). In addition, 7 of the 15 reported genotypes for the Prion gene were found: ARR/ARR (17.9%), ARR/AHQ (10.7%), ARR/ARQ (42.9%), ARQ/AHQ (10.7%), ARQ/ARQ (7.1%), ARR/VRQ (7.1%) and ARQ/VRQ (3.6%). Finally, 82.1% of the animals had genotypes resistant to the disease and 17.9% showed genotypes of susceptibility.El objetivo del presente trabajo fue establecer la frecuencia de genotipos de resistencia y susceptibilidad a padecer la enfermedad de scrapie en ovejas Junín. Se analizaron 56 muestras de sangre de ovinos de una unidad de producción privada de la región central del Perú. Se extrajo el ADN y los productos de PCR fueron analizados mediante digestión enzimática con endonucleasas de restricción que reconocen los polimorfismos del gen PrP. Se pudo identificar 4 de los 5 haplotipos reportados para el gen PrP: ARR (48.2%), ARQ (35.7%), AHQ (10.7%) y VRQ (5.4%). Además, se encontró 7 de los 15 genotipos reportados para el gen Prión: ARR/ARR (17.9%), ARR/AHQ (10.7%), ARR/ ARQ (42.9%), ARQ/AHQ (10.7%), ARQ/ARQ (7.1%), ARR/VRQ (7.1%) y ARQ/VRQ (3.6%). El 82.1% de las ovejas presentaron genotipos de resistencia a la enfermedad y el 17.9% presentó genotipos de susceptibilidad