Caracterización de los factores involucrados en la regulación del sistema FAS-I de micobacterias

La tuberculosis continúa siendo una de las enfermedades infecciosas que provoca la mayor cantidad de muerte entre los adultos. Mycobacterium tuberculosis es el agente etiológico de la tuberculosis y el éxito de este patógeno se debe en gran medida a su notable capacidad para sobrevivir en el huésped infectado, donde puede persistir durante varias décadas; siendo su inusual pared celular un factor clave en esta supervivencia. Los ácidos micólicos (MA) son los componentes mayoritarios de su envoltura celular y los responsables de muchas de las características de esta bacteria, como ser, su patogenicidad y su alta resistencia a los antibióticos comúnmente utilizados en la clínica. La biosíntesis de los MA involucra dos sintasas de ácidos grasos (FAS) diferentes, denominadas FAS-I y FAS-II. A pesar de la relevancia de la co-existencia de los dos sistemas (FAS-I y FAS-II) en micobacterias, tanto por su rol en la síntesis de los MA y ácidos grasos (FA) de membrana y lípidos de reserva, como por ser el blanco de poderosas drogas antituberculosas, es muy poco lo que se sabe acerca de cómo se regula el funcionamiento de estas dos rutas biosintéticas. Es por esto que se en esta tesis se desarrollaron dos métodos utilizando LC-MS para analizar por un lado el perfil de acil-CoAs, metabolitos intermediarios en la síntesis de lípidos, y por otro un estudio detallado de los lípidos totales en micobacterias. Estas herramientas permitieron al laboratorio analizar en profundidad distintas mutantes en el sistema lipídico en micobacterias. Además, utilizando a M. smegmatis como modelo de estudio, se construyó en el laboratorio una mutante condicional en el gen fas para poder reducir los niveles de esta enzima y estudiar así la interacción entre los dos sistemas FAS. Al observarse que, a pesar de la expresión del sistema FAS-I encontrarse reducida, la producción de MA en la mutante condicional no se encontraba inhibida, decidimos analizar en profundidad el metabolismo lipídico en estas condiciones utilizando las herramientas desarrolladas. De esta manera, junto con un análisis de proteómica de cuantitativa de la mutante condicional, se pudo determinar los efectos de la depleción parcial del sistema FAS-I en el metabolismo lipídico general en M. smegmatis y de esta manera inferir como ambos sistemas FAS se encuentran co-regulados. Estos resultados ayudarán a entender la regulación involucrada en el mantenimiento de la homeostasis lipídica en micobacterias, la cual creemos que proveerá nuevas herramientas para desarrollar nuevos agentes antimicobacterianos.Fil: Cabruja, Matías Ezequiel. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario (IBR-CONICET); Argentina

Caracterización de los factores involucrados en la regulación del sistema FAS-I de micobacterias

La tuberculosis continúa siendo una de las enfermedades infecciosas que provoca la mayor cantidad de muerte entre los adultos. Mycobacterium tuberculosis es el agente etiológico de la tuberculosis y el éxito de este patógeno se debe en gran medida a su notable capacidad para sobrevivir en el huésped infectado, donde puede persistir durante varias décadas; siendo su inusual pared celular un factor clave en esta supervivencia. Los ácidos micólicos (MA) son los componentes mayoritarios de su envoltura celular y los responsables de muchas de las características de esta bacteria, como ser, su patogenicidad y su alta resistencia a los antibióticos comúnmente utilizados en la clínica. La biosíntesis de los MA involucra dos sintasas de ácidos grasos (FAS) diferentes, denominadas FAS-I y FAS-II. A pesar de la relevancia de la co-existencia de los dos sistemas (FAS-I y FAS-II) en micobacterias, tanto por su rol en la síntesis de los MA y ácidos grasos (FA) de membrana y lípidos de reserva, como por ser el blanco de poderosas drogas antituberculosas, es muy poco lo que se sabe acerca de cómo se regula el funcionamiento de estas dos rutas biosintéticas. Es por esto que se en esta tesis se desarrollaron dos métodos utilizando LC-MS para analizar por un lado el perfil de acil-CoAs, metabolitos intermediarios en la síntesis de lípidos, y por otro un estudio detallado de los lípidos totales en micobacterias. Estas herramientas permitieron al laboratorio analizar en profundidad distintas mutantes en el sistema lipídico en micobacterias. Además, utilizando a M. smegmatis como modelo de estudio, se construyó en el laboratorio una mutante condicional en el gen fas para poder reducir los niveles de esta enzima y estudiar así la interacción entre los dos sistemas FAS. Al observarse que, a pesar de la expresión del sistema FAS-I encontrarse reducida, la producción de MA en la mutante condicional no se encontraba inhibida, decidimos analizar en profundidad el metabolismo lipídico en estas condiciones utilizando las herramientas desarrolladas. De esta manera, junto con un análisis de proteómica de cuantitativa de la mutante condicional, se pudo determinar los efectos de la depleción parcial del sistema FAS-I en el metabolismo lipídico general en M. smegmatis y de esta manera inferir como ambos sistemas FAS se encuentran co-regulados. Estos resultados ayudarán a entender la regulación involucrada en el mantenimiento de la homeostasis lipídica en micobacterias, la cual creemos que proveerá nuevas herramientas para desarrollar nuevos agentes antimicobacterianos.Fil: Cabruja, Matías Ezequiel. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario (IBR-CONICET); Argentina

Characterization of key enzymes involved in triacylglycerol biosynthesis in mycobacteria

Phosphatidic acid phosphatase (PAP) catalyzes the dephosphorylation of phosphatidic acid (PA) yielding diacylglycerol (DAG), the lipid precursor for triacylglycerol (TAG) biosynthesis. PAP activity has a key role in the regulation of PA flux towards TAG or glycerophospholipid synthesis. In this work we have characterized two Mycobacterium smegmatis genes encoding for functional PAP proteins. Disruption of both genes provoked a sharp reduction in de novo TAG biosynthesis in early growth phase cultures under stress conditions. In vivo labeling experiments demonstrated that TAG biosynthesis was restored in the ∆PAP mutant when bacteria reached exponential growth phase, with a concomitant reduction of phospholipid synthesis. In addition, comparative lipidomic analysis showed that the ∆PAP strain had increased levels of odd chain fatty acids esterified into TAGs, suggesting that the absence of PAP activity triggered other rearrangements of lipid metabolism, like phospholipid recycling, in order to maintain the wild type levels of TAG. Finally, the lipid changes observed in the ∆PAP mutant led to defective biofilm formation. Understanding the interaction between TAG synthesis and the lipid composition of mycobacterial cell envelope is a key step to better understand how lipid homeostasis is regulated during Mycobacterium tuberculosis infection.Fil: CrottaAsis, Agostina. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario (IBR-CONICET). Argentina.Fil: Savoretti, Franco. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario (IBR-CONICET). Argentina.Fil: Cabruja, Matías Exequiel. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario (IBR-CONICET). Argentina.Fil: Gramajo, Hugo Cesar. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario (IBR-CONICET). Argentina.Fil: Gago, Gabriela. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario (IBR-CONICET). Argentina

Correction: Pleiotropic Effect of AccD5 and AccE5 Depletion in Acyl-Coenzyme A Carboxylase Activity and in Lipid Biosynthesis in Mycobacteria.

[This corrects the article DOI: 10.1371/journal.pone.0099853.]

Pleiotropic effect of AccD5 and AccE5 depletion in acyl-coenzyme A carboxylase activity and in lipid biosynthesis in mycobacteria.

Mycobacteria contain a large variety of fatty acids which are used for the biosynthesis of several complex cell wall lipids that have been implicated in the ability of the organism to resist host defenses. The building blocks for the biosynthesis of all these lipids are provided by a fairly complex set of acyl-CoA carboxylases (ACCases) whose subunit composition and roles within these organisms have not yet been clearly established. Previous biochemical and structural studies provided strong evidences that ACCase 5 from Mycobacterium tuberculosis is formed by the AccA3, AccD5 and AccE5 subunits and that this enzyme complex carboxylates acetyl-CoA and propionyl-CoA with a clear substrate preference for the latest. In this work we used a genetic approach to unambiguously demonstrate that the products of both accD5 and accE5 genes are essential for the viability of Mycobacterium smegmatis. By obtaining a conditional mutant on the accD5-accE5 operon, we also demonstrated that the main physiological role of this enzyme complex was to provide the substrates for fatty acid and mycolic acid biosynthesis. Furthermore, enzymatic and biochemical analysis of the conditional mutant provided strong evidences supporting the notion that AccD5 and/or AccE5 have an additional role in the carboxylation of long chain acyl-CoA prior to mycolic acid condensation. These studies represent a significant step towards a better understanding of the roles of ACCases in mycobacteria and confirm ACCase 5 as an interesting target for the development of new antimycobacterial drugs

Supplementary Tables S1 - S3 from Role of long-chain acyl-CoAs in the regulation of mycolic acid biosynthesis in mycobacteria

S1 Table. Plasmids used in this work.; S2 Table. Strains used in this work.; S3 Table. RT primers used in this study

Fig S3 from Role of long-chain acyl-CoAs in the regulation of mycolic acid biosynthesis in mycobacteria

<b>Effect of C₂₆-CoA on the formation of C₂₀-CoA/ His₆-MabR_MT /P<i>fasII</i> complex.</b> His₆-MabR_MT was preincubated during 5 min with C₂₆-CoA in the presence of poly-dIdC, prior to the addition of C₂₀-CoA and 5 min later, P<i>fasII</i> probe was added (last 2 lanes). The His₆-MabR_MT-DNA complex formation was also assayed with the individual addition of different concentrations of C₂₀-CoA (lanes 3-6) or C₂₆-CoA (lanes 7-10), as controls of the experiment

The Opportunistic Human Pathogen Acinetobacter baumannii Senses and Responds to Light▿ †

Light is a ubiquitous environmental signal that many organisms sense and respond to by modulating their physiological responses accordingly. While this is an expected response among phototrophic microorganisms, the ability of chemotrophic prokaryotes to sense and react to light has become a puzzling and novel issue in bacterial physiology, particularly among bacterial pathogens. In this work, we show that the opportunistic pathogen Acinetobacter baumannii senses and responds to blue light. Motility and formation of biofilms and pellicles were observed only when bacterial cells were incubated in darkness. In contrast, the killing of Candida albicans filaments was enhanced when they were cocultured with bacteria under light. These bacterial responses depend on the expression of the A. baumannii ATCC 17978 A1S_2225 gene, which codes for an 18.6-kDa protein that contains an N-terminal blue-light-sensing-using flavin (BLUF) domain and lacks a detectable output domain(s). Spectral analyses of the purified recombinant protein showed its ability to sense light by a red shift upon illumination. Therefore, the A1S_2225 gene, which is present in several members of the Acinetobacter genus, was named blue-light-sensing A (blsA). Interestingly, temperature plays a role in the ability of A. baumannii to sense and respond to light via the BlsA photoreceptor protein

Figuras S1-S8 from A conditional mutant of the fatty acid synthase unveils unexpected cross talks in mycobacterial lipid metabolism

Unlike most bacteria, mycobacteria rely on the multi-domain enzyme eukaryote-like fatty acid synthase I (FAS I) to make fatty acids de novo. These metabolites are precursors of the biosynthesis of most of the lipids present both in the complex mycobacteria cell wall and in the storage lipids inside the cell. In order to study the role of the type I FAS system in <i>Mycobacterium</i> lipid metabolism <i>in vivo</i>, we constructed a conditional mutant in the <i>fas-acpS</i> operon of <i>Mycobacterium smegmatis</i> and analysed in detail the impact of reduced de novo fatty acid biosynthesis on the global architecture of the cell envelope. As expected, the mutant exhibited growth defect in the non-permissive condition that correlated well with the lower expression of <i>fas-acpS</i> and the concomitant reduction of FAS I, confirming that FAS I is essential for survival. The reduction observed in FAS I provoked an accumulation of its substrates, acetyl-CoA and malonyl-CoA, and a strong reduction of C₁₂ to C₁₈ acyl-CoAs but not of long-chain acyl-CoAs (C₁₉ to C₂₄). The most intriguing result was the ability of the mutant to keep synthesizing mycolic acids when fatty acid biosynthesis was impaired. A detailed comparative lipidomic analysis showed that although reduced FAS I levels had a strong impact on fatty acid and phospholipid biosynthesis, mycolic acids were still being synthesized in the mutant, although with a different relative species distribution. However, when triacylglycerol degradation was inhibited, mycolic acid biosynthesis was significantly reduced, suggesting that storage lipids could be an intracellular reservoir of fatty acids for the biosynthesis of complex lipids in mycobacteria. Understanding the interaction between FAS I and the metabolic pathways that rely on FAS I products is a key step to better understand how lipid homeostasis is regulated in this microorganism and how this regulation could play a role during infection in pathogenic mycobacteria