Melatonina no meio de maturação não melhorou as taxas de maturação dos ovócitos, de desenvolvimento embrionário e a fragmentação do DNA dos embriões bovinos

Melatonin (MEL) acts as a powerful scavenger of free radicals and direct gonadal responses to melatonin have been reported in the literature. Few studies, however, have evaluated the effect of MEL during in vitro maturation (IVM) on bovine embryos. This study tested the addition of MEL to maturation medium (MM) with no gonadotropins on nuclear maturation and embryo development rates and the incidence of DNA damage in resulting embryos. Cumulus-oocyte complexes were aspirated from abattoir ovaries and cultured in MM (TCM-199 medium supplemented with 10% fetal calf serum - FCS) at 39ºC and 5% CO2 in air. After 24 hours of culture in MM with 0.5 µg mL-1 FSH and 5.0 µg mL-1 LH; 10-9 M MEL) or 10-9 M MEL, 0.5 µg mL-1 FSH and 5.0 µg mL-1 LH, the oocytes were stained with Hoechst 33342 to evaluate nuclear maturation rate. After in vitro fertilization and embryo culture, development rates were evaluated and the blastocysts were assessed for DNA damage by Comet assay. There was no effect of melatonin added to the MM, alone or in combination with gonadotropins, on nuclear maturation, cleavage and blastocyst rates. These rates ranged between 88% to 90%, 85% to 88% and 42% to 46%, respectively. The extent of DNA damage in embryos was also not affected by MEL supplementation during IVM. The addition of 10-9 M MEL to the MM failed to improve nuclear maturation and embryo development rates and the incidence of DNA damage in resulting embryos, but was able to properly substitute for gonadotropins during IVM.Melatonin (MEL) atua como um potente redutor de radicais livres. Efeito direto da MEL na função gonadal também foi observado. Existem poucos estudos relacionados ao efeito da MEL durante a maturação no desenvolvimento embrionário in vitro. Avaliou-se a adição de MEL no meio de maturação (sem gonadotrofinas) nas taxas de maturação nuclear e de desenvolvimento embrionário e na incidência de fragmentação do DNA nos embriões produzidos in vitro. Complexos cumulus-ovócitos foram aspirados de ovários provenientes de matadouros e cultivados em meio de maturação (Meio TCM-199 suplementado com 10% de soro fetal bovino) a 39ºC e 5% CO2 em ar. Após 24 horas de cultivo em meio de maturação com 0,5 µg mL-1 de FSH e 5,0 µg mL-1 de LH; 10-9 M de MEL ou 10-9 M de MEL, 0,5 µg mL-1 de FSH e 5,0 µg mL-1 de LH, os ovócitos foram corados com Hoechst 33342 para avaliação da taxa de maturação nuclear. A fragmentação do DNA dos blastocistos foi avaliada pela técnica do Cometa. Não houve efeito da MEL adicionada ao meio de maturação, com ou sem gonadotrofinas, nas taxas de maturação nuclear, clivagem e blastocistos. Os percentuais variaram entre 88% a 90%, 85% a 88% e 42% a 46%, respectivamente. O grau de fragmentação do DNA também não foi afetado pela adição de MEL ao meio de maturação. A adição de 10-9 M de MEL ao meio de maturação não exerce influência nas taxas de maturação nuclear e de desenvolvimento embrionário e nem da incidência de fragmentação do DNA dos embriões produzidos in vitro, mas pode substituir as gonadotropinas durante a maturação in vitro.Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP

Melatonin in maturation media fails to improve oocyte maturation, embryo development rates and DNA damage of bovine embryos

Melatonin (MEL) acts as a powerful scavenger of free radicals and direct gonadal responses to melatonin have been reported in the literature. Few studies, however, have evaluated the effect of MEL during in vitro maturation (IVM) on bovine embryos. This study tested the addition of MEL to maturation medium (MM) with no gonadotropins on nuclear maturation and embryo development rates and the incidence of DNA damage in resulting embryos. Cumulus-oocyte complexes were aspirated from abattoir ovaries and cultured in MM (TCM-199 medium supplemented with 10% fetal calf serum - FCS) at 39ºC and 5% CO2 in air. After 24 hours of culture in MM with 0.5 µg mL-1 FSH and 5.0 µg mL-1 LH; 10-9 M MEL) or 10-9 M MEL, 0.5 µg mL-1 FSH and 5.0 µg mL-1 LH, the oocytes were stained with Hoechst 33342 to evaluate nuclear maturation rate. After in vitro fertilization and embryo culture, development rates were evaluated and the blastocysts were assessed for DNA damage by Comet assay. There was no effect of melatonin added to the MM, alone or in combination with gonadotropins, on nuclear maturation, cleavage and blastocyst rates. These rates ranged between 88% to 90%, 85% to 88% and 42% to 46%, respectively. The extent of DNA damage in embryos was also not affected by MEL supplementation during IVM. The addition of 10-9 M MEL to the MM failed to improve nuclear maturation and embryo development rates and the incidence of DNA damage in resulting embryos, but was able to properly substitute for gonadotropins during IVM.Melatonin (MEL) atua como um potente redutor de radicais livres. Efeito direto da MEL na função gonadal também foi observado. Existem poucos estudos relacionados ao efeito da MEL durante a maturação no desenvolvimento embrionário in vitro. Avaliou-se a adição de MEL no meio de maturação (sem gonadotrofinas) nas taxas de maturação nuclear e de desenvolvimento embrionário e na incidência de fragmentação do DNA nos embriões produzidos in vitro. Complexos cumulus-ovócitos foram aspirados de ovários provenientes de matadouros e cultivados em meio de maturação (Meio TCM-199 suplementado com 10% de soro fetal bovino) a 39ºC e 5% CO2 em ar. Após 24 horas de cultivo em meio de maturação com 0,5 µg mL-1 de FSH e 5,0 µg mL-1 de LH; 10-9 M de MEL ou 10-9 M de MEL, 0,5 µg mL-1 de FSH e 5,0 µg mL-1 de LH, os ovócitos foram corados com Hoechst 33342 para avaliação da taxa de maturação nuclear. A fragmentação do DNA dos blastocistos foi avaliada pela técnica do Cometa. Não houve efeito da MEL adicionada ao meio de maturação, com ou sem gonadotrofinas, nas taxas de maturação nuclear, clivagem e blastocistos. Os percentuais variaram entre 88% a 90%, 85% a 88% e 42% a 46%, respectivamente. O grau de fragmentação do DNA também não foi afetado pela adição de MEL ao meio de maturação. A adição de 10-9 M de MEL ao meio de maturação não exerce influência nas taxas de maturação nuclear e de desenvolvimento embrionário e nem da incidência de fragmentação do DNA dos embriões produzidos in vitro, mas pode substituir as gonadotropinas durante a maturação in vitro

Eficácia da transferência de embriões a fresco oriundos de bovinos das raças Holandesa e Simental

The efficacy of transferred fresh embryos was evaluated. Donors were superovulated on day 10 of the estrous cycle with 8, 7, 5 e 4 mg (48 mg) or 7, 6,4 e 3 mg (40 mg) of follicle stimulating hormonepituitary (FSH-P) twice a day, during four days. Analogue prostaglandin (cloprostenol) was injected on day 12 of the cycle and inseminations with frozen semen two or three times were performed, each 12 hours. Nonsurgical recovery of the embryos was performed with "Neustad a.d. Aisch" catheter, introducing the medium into the uterine horns with syringes. The uterine horns were flushed with modified Dulbecco's phosphate buffered saline (PBS) enriched with 1% of foetal calf serum at 36 °C. After the recovery, the embryos were morphologically evaluated under a stereomicroscope at 16x and 70x magnifications. The embryos transfers were surgically conducted through flank incision and pregnancy diagnosis made through rectal palpation on day 45-60after transfer. Two hundred twenty one embryos from Holstein cows and thirty seven from Simmental were transferred to two hundred fifty eight cross bred heifers. Pregnancy rates for fresh embryo transfer from Holstein and Simmental cows were 73.3% and 83.3%the values were not statistically different.Este trabalho foi conduzido com o propósito de se verificar a eficácia da transferência de embriões bovinos a fresco. Para tanto, vacas doadoras foram superovuladas a partir do 10º dia do ciclo estral com FSH-P na dose de 40 ou 48 mg, via intramuscular, em duas doses diárias decrescentes, por quatro dias, seguida da administração de Cloprostenolno 12º dia do ciclo e duas a três inseminações, a intervalos de 12 horas, quando no cio. Os embriões foram recuperados através de lavagem uterina no 7º dia após o cio, sendo cada corno uterino lavado com 300 a 400 ml de Dulbecco modificado (PBS), enriquecido com1% de soro fetal bovino. Após análise morfológica sob lupa estereoscópica, os embriões foram transferidos cirurgicamente, via incisão para-lombar, para o corno uterino de receptoras previamente selecionadas. Um total de 258 embriões, sendo 221 de doadoras da raçaHolandesa e 37 da raça Simental, foram transferidos para 258 novilhas que, decorridos 45 a 60 dias da transferência, foram palpadas, por via retal, para constatação da prenhez. Foram observados, respectivamente, para embriões de vacas Holandesas e Simentais, 73,3% e 83,3% de gestações, diferença estatisticamente não significante

Possível associação entre tipos de hemoglobina e problemas reprodutivos em éguas Mangalarga brasileiras

In the present report the biochemical polymorphism of Mangalarga mares hemoglobin, in reproductive age, from Santa Fé Farm, Botucatu, São Paulo, was studied. Animals were classified in two groups, according to reproductive history of each mare; the first group was performed by normal mares (control group) and the second one by animals with reproductive disorders (barren mares). From each animal, around 15 ml of vessel blood were collected. Hemoglobins were typed by polyacrylamide gel electrophoresis, 7% of concentration in the resolving gel, in a discontinuous alkaline (pH 8.6) buffer system. The following hemoglobins phenotypes were found in the control group, with the respective frequencies:A¹--- (2,0%), A¹, A²m+m+ (21,0%) e A¹A² m+m (27,0%). To the group performed by reproductive disorders carrier animals the following results were obtained : A¹--- (10,0%), A¹A² m+m+ (12,0%) e A¹A²m+m+ (28,0%). The difference observed in the A¹--- phenotype between the groups may be due to a probable liaison with hemoglobin locus and another one related with reproductive traits. Besides this fact, tropical environment effects may be acting on this locus, thus leading to obtained resultsForam estudadas as hemoglobinas de 100 éguas da raça Mangalarga, em idade de reprodução, provenientes da Fazenda Santa Fé, situada na região de Botucatu. Esses animais foram divididos em 2 grupos, de acordo com o histórico reprodutivo de cada animal, sendo um formado por éguas reprodutivamente normais e o segundo por éguas portadoras de problemas reprodutivos. Foram colhidas amostras de 15 ml de sangue com anticoagulante. As hemoglobinas foram identificadas por meio de eletroforese em gel de poliacrilamida em placa vertical, a 7% em pH 8.6, segundo Davis11 (1964). Quanto ao sistema de hemoglobinas, foram encontrados os seguintes fenótipos para o grupo de éguas reprodutivamente normais:A¹--- (2,0%), A¹, A²m+m+ (21,0%) e A¹A² m+m (27,0%); para o grupo de éguas com problemas reprodutivos: A¹--- (10,0%), A¹A² m+m+ (12,0%) e A¹A²m+m+ (28,0%). A diferença na freqüência do fenótipo A¹--- entre os grupos pode ter ocorrido devido ã existência da ligação do loco hemoglobina a outro que controlaria características de produção. Além disso, pode estar ocorrendo influência do tipo de clima existente nos trópicos

Use of Bayesian Inference to Correlate In Vitro Embryo Production and In Vivo Fertility in Zebu Bulls

The objective of this experiment was to test in vitro embryo production (IVP) as a tool to estimate fertility performance in zebu bulls using Bayesian inference statistics. Oocytes were matured and fertilized in vitro using sperm cells from three different Zebu bulls (V, T, and G). The three bulls presented similar results with regard to pronuclear formation and blastocyst formation rates. However, the cleavage rates were different between bulls. The estimated conception rates based on combined data of cleavage and blastocyst formation were very similar to the true conception rates observed for the same bulls after a fixed-time artificial insemination program. Moreover, even when we used cleavage rate data only or blastocyst formation data only, the estimated conception rates were still close to the true conception rates. We conclude that Bayesian inference is an effective statistical procedure to estimate in vivo bull fertility using data from IVP

Bull semen varibles after experimental exposure with Bovine Herpesvirus type 5

The influence of Bovine Herpesvirus type 5 (BoHV-5) infection on semen variables and sperm morphology collected from healthy bulls with no reproductive disorder was evaluated in ten ejaculates distributed into two experimental groups: group 1, bull semen exposed to 10(2.3) (tissue culture infectious dose) TCID(50)/50 mu l of a Brazilian strain of BoHV-5 (US9/BR/2007; GU9457818) and group II, unexposed bull control semen. After experimental infection, the semen was frozen-thawed prior to computerized analysis (CASA) of sperm motility and movement. Also analyzed were sperm phosphatidylserine transposition, acrosomal integrity, mitochondrial function, plasma membrane integrity and Annexin V expression. Viable BoHV-5 particles and their DNA were detected in infected semen after virus isolation and in situ hybridization (ISH) assay. The ISH revealed the BoHV-5 US9 gene in the acrosome and tail of infected spermatozoa. The only remarkable differences between groups land II were the sperm kinetic variables, whereby infected sperm had a lesser mean velocity (VAP) and curvilinear velocity (VCL) values as compared to controls (P <= 0.05). However, the straightness coefficient (STR) and beat cross frequency (BCF) values were higher in infected sperm. These results indicate that BoHV-5 can be found in infected sperm but induces no functional and morphological damage even after freeze-thawing, and, importantly, BoHV-5 can be spread via in vitro and in vivo reproductive biotechnology procedures. (C) 2011 Elsevier B.V. All rights reserved.Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP

Influence of lineage of oocyte donor on the yield and morphology of oocytes recovered by ultrasound-guided follicular aspiration in nellore cows

The objective of this study was to investigate the influence of lineage of oocytes donors on the number and quality of oocytes obtained through ultrasound-guided follicular aspiration in Nellore breed cows derived from two lineages of bulls (Karvadi; K and Taj-Mahal; T). Both maternal (Km and Tm) and paternal (Kp and Tp) lineages, as well as their combinations were investigated. Oocyte aspirations were repeatedly performed with an aspiration interval of 15 days in 56 donor females. Recovered cumulus oocyte-complexes (COCs) were counted, morphologically examined and classified into seven categories (grades from I to VII) according to the number of layers of the cumulus oocyte and cytoplasm appearance. The mean number of oocytes retrieved from donors of lineage Tp-Tm was significantly higher (28.23±1.92, P<0.05) than those obtained from lineages Kp-Tm, Kp-Km, and Tp-Km (21.34±1.32, 21.28±1.73, and 16.72±1.31, respectively). There was no significant difference in the mean number of recovered oocytes between donors of lineages Kp-Km and Kp-Tm, whereas animals of lineage Tp-Km yielded the lowest number of oocytes. Higher mean number of grade III oocytes was recovered from donors of lineage Kp than lineage Tp (10.11±0.66 versus 8.79±0.58, respectively), with more grade III oocytes being obtained in both lineages as compared to the others. Paternal lineage did not influence the quality of recovered oocytes in any other category, but both Kp and Tp yielded a great mean number of oocytes graded as I, II, and III (3.14±0.21; 4.93±0.33, and 10.11±0.66 versus 3.19±0.21, 5.59±0.44, and 8.79±0.58, respectively) than those classified as IV, V, VI, and VII. However, when considering the data from the maternal lineage significantly more oocytes (P<0.05) of grade I, II and III were obtained from Taj-Mahal (11.67 ± 0.67, 5.9±0.42 and 3.64±0.25, respectively) than for lineage Karvadi, with similar results for oocytes of grades IV, V, VI, and VII. Similarly to the paternal lineage, the number of oocytes of grade III was superior (P<0.05) when compared to other categories for both lineages. In conclusion, we demonstrate here a direct influence of lineage of oocyte donor on the production and quality of oocytes obtained through ultrasound-guided follicular aspiration in Nellore cows.El objetivo de este estudio fue investigar la influencia del linaje de las donadoras de ovocitos en el número y la calidad de los ovocitos obtenidos por aspiración folicular guiada por ecografía en animales de la raza Nelore, descendientes de dos linajes de toros (Karvadi, K y Taj-Mahal, T). Fueron evaluados los linajes maternos (Km y Tm) paternos (Kp y Tp) y sus combinaciones. Fueron realizadas varias aspiraciones de ovocitos en un intervalo de 15 días en 56 donadoras. Los ovocitos fueron contados, analizados morfológicamente y clasificados en siete categorías (grados I a VII) en función del número de células del cumulus y el aspecto del citoplasma. El número medio de ovocitos recuperados de donadoras del linaje Tp-Tm fue significativamente mayor (28,23 ± 1,92, P<0,05) que los de los linajes Kp-Tm, Kp-Km y Tp-Km (21,34±1,32, 21,28±1,73 y 16,72±1,31), respectivamente. No hubo diferencia significativa en el número medio de ovocitos recolectados de las donadoras Kp-Km y Kp-Tm, mientras que los animales Tp-Km produjeron la menor cantidad de ovocitos. Fueron recuperados más ovocitos (P<0,05) de grado III del linaje donador Kp que del linaje Tp (10,11±0,66 contra 8,79±0,58, respectivamente), con mayor número de ovocitos grado III obtenidos en esos dos linajes en comparación con los demás. El linaje paterno no afectó la calidad de los ovocitos en ninguna de las categorías, pero ambos linajes Kp y Tp produjeron un gran número de ovocitos de grados I, II y III (3,14±0,21, 4,93±0,33 y 10,11±0,66 contra 3,19±0,21, 5,59±0,44 y 8,79±0,58, respectivamente) de los clasificados como grado IV, V, VI y VII. Sin embargo, cuando fueron considerados los datos del linaje materno, se obtuvieron más ovocitos (P<0,05) para los grados I, II y III a partir del linaje de Taj-Mahal (11,67±0,67, 5,9±0,42 y 3,64±0.25, respectivamente) que del linaje Karvadi, con resultados similares a los ovocitos de los grados IV, V, VI y VII. Del mismo modo que el linaje paterno, el número de ovocitos de grado III fue mayor (P<0,05) en comparación con las categorías para ambos linajes. En conclusión, se demostró la influencia directa del linaje de las donadoras de ovocitos en el número y la calidad de los ovocitos obtenidos por aspiración folicular guiada por ecografía en vaquillas Nelore.O objetivo deste estudo foi investigar a influência da linhagem da doadora de oócito sobre o número e qualidade morfológica de oócitos obtidos através de aspiração folicular guiada por ultrassom em animais da raça Nelore, descendentes de duas linhagens de touros (Karvadi; K e Taj-Mahal; T). As linhagens maternas (Km e Tm) e paternas (Kp e Tp), e suas combinações, foram avaliadas. As aspirações de oócitos foram repetidamente realizadas em um intervalo de 15 dias em 56 doadoras. Os oócitos obtidos foram contados, analisados morfologicamente e classificados em sete categorias (graus I a VII), de acordo com o número de células do cumulus e aparência do citoplasma. O número médio de oócitos recuperados das doadoras da linhagem Tp-Tm foi significativamente maior (28,23 ± 1,92, P<0,05) do que os das linhagens Kp-Tm, Kp-Km, and Tp-Km (21,34±1,32; 21,28±1,73 e 16,72±1,31, respectivamente). Não houve diferença significativa no número médio de oócitos colhidos entre as doadoras das linhagens Kp-Km e Kp-Tm, enquanto que animais da linhagem Tp-Km produziram o mais baixo número de oócitos. Um maior número (P<0,05) de oócitos de grau III foi recuperado das doadoras da linhagem Kp do que da linhagem Tp (10,11±0,66 versus 8,79±0,58, respectivamente), com uma maior quantidade de oócitos de grau III sendo obtida em ambas as linhagens quando comparado com as demais. A linhagem paterna não influenciou na qualidade dos oócitos aspirados em nenhuma das categorias, mas ambas as linhagens Kp e Tp produziram um maior número de oócitos de graus I, II e III (3,14±0,21; 4,93±0,33 e 10,11±0,66 versus 3,19±0,21; 5,59±0,44 e 8,79±0,58, respectivamente) do que aqueles classificados como de graus IV, V, VI e VII. Entretanto, quando os dados da linhagem materna foram considerados, mais oócitos (P<0.05) de graus I, II e III foram obtidos da linhagem Taj-Mahal (11,67 ± 0,67; 5,9±0,42 e 3,64±0,25, respectivamente) do que para a linhagem Karvadi, com resultados similares para os oócitos de graus IV, V, VI e VII. Da mesma forma que a linhagem paterna, o número de oócitos de grau III foi superior (P<0,05) quando comparado com as categorias, nas duas linhagens. Concluindo, demonstramos a influência direta da linhagem da doadora de oócito sobre o número e qualidade dos oócitos obtidos pela aspiração folicular guiada por ultrassom em vacas da raça Nelore

Associação entre classe econômica e estresse na ocorrência da disfunção temporomandibular

Objetivou-se neste estudo verificar a associação da classe econômica e do estresse com a ocorrência de disfunção temporomandibular (DTM). A população deste estudo constituiu-se de uma amostra estatisticamente significativa de 354 indivíduos de ambos os sexos, pertencentes a diferentes classes econômicas da zona urbana do município de Piacatu, São Paulo, Brasil. Para isso, utilizou-se o Critério de Classificação Econômica Brasil (CCEB) para a estratificação econômica da população. Retirou-se uma amostra de cada estrato, na qual aplicou-se o Questionário de Fonseca para verificar o grau de DTM, e a Escala de Reajustamento Social (SRRS) para verificar o grau de estresse. Os dados coletados foram tabulados por meio do programa Epi Info 2000, versão 3.2, e analisados estatisticamente por meio do Teste Qui-Quadrado, com nível de significância de 5%. Os chefes das famílias foram assim distribuídos: 4 famílias pertencentes à Classe A2, 14 à Classe B1, 25 à Classe B2, 112 à Classe C, 174 à Classe D e 25 à Classe E. Após a análise estatística não foi observada associação significativa entre classe econômica e disfunção temporomandibular (DTM); entretanto, a mesma ocorreu entre estresse e DTM (p<0,01). A classe econômica não influencia na ocorrência de DTM, mas existe associação direta entre estresse e disfunção temporomandibular.The objective of this study was to verify the association between socio-economic class and stress in temporomandibular joint dysfunction (TMD). The population of this study consisted of a statistically significant sample of 354 subjects of both genders ranging in different socio-economic classes of the urban area of the municipality of Piacatu, São Paulo, Brazil. Toward that end, the Brazilian Economic Classification Criteria was used for the economic stratification of the population. A sample of each extract was taken, and then Fonseca's Questionnaire was applied to verify the level of TMD, and the Social Readjustment Rating Scale (SRRS) was used to verify stress level. The data collected were tabulated by Epi-Info 2000, v. 3.2 and statistically analyzed through the Chi-square Test, with a level of significance of 5%. The heads of households of the families were distributed as follows: 4 belonging to Class A2, 14 to Class B1, 25 to Class B2, 112 to Class C, 174 to Class D, and 25 to Class E. After the statistical analysis, no statistically significant association was observed between economic class and TMD. However, this type of relationship was verified between stress and TMD (p<0.01). The economic class does not influence in the occurrence of TMD, but there is an association between stress and temporomandibular joint dysfunction