Two-photon Imaging of Microglial Processes' Attraction Toward ATP or Serotonin in Acute Brain Slices

International audienceMicroglial cells are resident innate immune cells of the brain that constantly scan their environment with their long processes and, upon disruption of homeostasis, undergo rapid morphological changes. For example, a laser lesion induces in a few minutes an oriented growth of microglial processes, also called "directional motility", toward the site of injury. A similar effect can be obtained by delivering locally ATP or serotonin (5-hydroxytryptamine [5-HT]). In this article, we describe a protocol to induce a directional growth of microglial processes toward a local application of ATP or 5-HT in acute brain slices of young and adult mice and to image this attraction over time by multiphoton microscopy. A simple method of quantification with free and open-source image analysis software is proposed. A challenge that still characterizes acute brain slices is the limited time, decreasing with age, during which the cells remain in a physiological state. This protocol, thus, highlights some technical improvements (medium, air-liquid interface chamber, imaging chamber with a double perfusion) aimed at optimizing the viability of microglial cells over several hours, especially in slices from adult mice

MOL#8268 1 Title Page. The natural mutation encoding a C-terminus truncated 5-HT 2B receptor is a gain of proliferative functions

Number of tables, 1 Number of references, 31 Number of words in the abstract, 230 Number of words in the Introduction, 744 Number of words in the Discussion. 1172 List of non-standard abbreviations receptor was identified in one patient diagnosed with pulmonary hypertension after intake of the anorexigen dexfenfluramine. Although reported to generate a lack of function, this C-terminus truncated 5-HT 2B receptor should somehow affect transduction pathways relevant to pulmonary hypertension. In our study, we investigated putative modifications in transduction of the R393X mutated 5-HT 2B receptor. In stably transfected cells, we confirmed the loss of IP 3 stimulation due to the G αq uncoupling, despite conserved ligand affinity between the normal and mutated receptors. We also observed a partial loss of nitric oxide synthase stimulation. However, the truncated R393X receptor presented (i) a strong gain of efficacy in cell proliferation as assessed by mitogen-activated protein kinase activity and thymidine incorporation, (ii) a preferential coupling to G α13 as shown by blocking antiserum, and (iii) an apparent lack of internalization upon agonist stimulation as observed by confocal microscopy. This work demonstrates that, in the 5-HT 2B receptor, the C-terminus including the palmitoylation and phosphorylation sites is absolutely required for proper transduction and internalization. For the first time, we show that the lack of C-terminus can generate a switch of coupling to G α13 , a reduced NO synthase activation and an increase in cell proliferation. All these modifications are relevant in pathophysiological vasoconstriction. MOL#8268 4 Introduction

Platelet-derived serotonin links vascular disease and tissue fibrosis

Blocking 5-HT2B receptor provides a therapeutic target for fibrotic diseases caused by activated platelet release of serotonin during vascular damage

5-Hydroxytryptamine receptors (version 2019.4) in the IUPHAR/BPS Guide to Pharmacology Database

oai:ojs.pkp.sfu.ca:article/31555-HT receptors (nomenclature as agreed by the NC-IUPHAR Subcommittee on 5-HT receptors [194] and subsequently revised [176]) are, with the exception of the ionotropic 5-HT3 class, GPCRs where the endogenous agonist is 5-hydroxytryptamine. The diversity of metabotropic 5-HT receptors is increased by alternative splicing that produces isoforms of the 5-HT2A (non-functional), 5-HT2C (non-functional), 5-HT4, 5-HT6 (non-functional) and 5-HT7 receptors. Unique amongst the GPCRs, RNA editing produces 5-HT2C receptor isoforms that differ in function, such as efficiency and specificity of coupling to Gq/11 and also pharmacology [40, 482]. Most 5-HT receptors (except 5-ht1e and 5-ht5b) play specific roles mediating functional responses in different tissues (reviewed by [463, 382])

5-Hydroxytryptamine receptors in GtoPdb v.2023.1

5-HT receptors (nomenclature as agreed by the NC-IUPHAR Subcommittee on 5-HT receptors [198] and subsequently revised [180]) are, with the exception of the ionotropic 5-HT3 class, GPCRs where the endogenous agonist is 5-hydroxytryptamine. The diversity of metabotropic 5-HT receptors is increased by alternative splicing that produces isoforms of the 5-HT2A (non-functional), 5-HT2C (non-functional), 5-HT4, 5-HT6 (non-functional) and 5-HT7 receptors. Unique amongst the GPCRs, RNA editing produces 5-HT2C receptor isoforms that differ in function, such as efficiency and specificity of coupling to Gq/11 and also pharmacology [40, 491]. Most 5-HT receptors (except 5-ht1e and 5-ht5b) play specific roles mediating functional responses in different tissues (reviewed by [471, 387])

Overexpression of 5-hydroxytryptamine 2B receptor gene in pulmonary hypertension: still a long way to understand its transcriptional regulation.

International audienc

Gene Structure, Expression, and 5-HT2B Receptor Signaling

International audienceAlthough the contractile effects of serotonin on stomach has been described since long time, the identification of the receptor mediating such a response was only obtained by molecular cloning in 1992. The pharmacological characterization of the 5-HT 2B receptor subtype in various species identified proximity but differences in its pharmacology, as compared to 5-HT 2A or 5-HT 2C receptors. Initially thought to be restricted in periphery, 5-HT 2B receptor expression was also detected in various cell types in the central nervous system. Although quite low at adult stage, a strong expression of 5-HT 2B receptors has been found early in embryos in migrating neural crest cells, neural tube, hematopoietic tissue, and heart primordia. In this chapter, we will develop and discuss the complexity of its signaling in relation with its expression, including in various types of cancer cells

La sérotonine dans la régulation de la balance énergétique (d'un régime hyperlipidique à une molécule hypophagique)

Dans le cerveau, la sérotonine (5-HT) est l'un des neurotransmetteurs contrôlant la prise alimentaire. Dans cette thèse, nous avons étudié sur deux aspects de la régulation de la prise alimentaire par la 5-HT. Dans un premier temps, nous avons examiné les effets d un régime hyperlipidique (HL). Puis dans la seconde partie de l étude nous nous sommes focalisés sur les mécanismes d action de la dexfenfluramine. Les premiers changements dans les voies neuroendocrines sont essentiels dans le développement de pathologies métaboliques. À long terme la consommation de l'alimentation déséquilibrée provoque l apparition d une résistance à l'insuline, de l'obésité, du diabète de type 2. Nous avons recherché les premiers changements neuroendocriniens dans l'hypothalamus induits par un régime HL. La dexfenfluramine (dF) a été prescrit comme une molécule anorexigène dans le traitement de l'obésité. La dF favorise la libération de la 5-HT et inhibe sa recapture. De plus, le principal métabolite de la dF, est un agoniste sélectif des récepteurs 5-HT2B/2C. Par conséquent, nous avons étudié le rôle des récepteurs 5-HT2B dans l effet de la dF sur la prise alimentaire.PARIS-BIUSJ-Physique recherche (751052113) / SudocSudocFranceF

Rôle des récepteurs 5-HT2B

Le rôle du récepteur 5-HT2B dans le système nerveux central est encore méconnu. En invalidant ce récepteur totalement, spécifiquement dans les neurones sérotoninergiques ou spécifiquement dans les neurones dopaminergiques, nous avons mis en évidence un rôle essentiel des récepteurs 5-HT2B présynaptiques et postsynaptiques. Les récepteurs 5-HT2B présynaptiques apparaissent être nécessaires aux effets biochimiques et comportementaux des molécules dérivées d amphétamine et des antidépresseurs qui agissent sur le transporteur de la sérotonine (SERT). L étude de la régulation du SERT par les récepteurs 5-HT2B dans l action de ces molécules a identifié deux sites potentiels de phosphorylation impliqués dans les mécanismes de recapture ou d efflux de sérotonine. Ce travail a également mis en évidence que les récepteurs 5-HT2B postsynaptiques, localisés sur les neurones dopaminergiques de l aire tegmentale ventrale, modulent l activité de ces neurones dans les mécanismes à l origine de l impulsivité et de l addiction. Ainsi, deux polymorphismes perte de fonction ont été identifiés chez l homme et associés à l impulsivité d une part et à l addiction d autre part. Enfin, l étude structurelle des récepteurs 5-HT2B a révélé un rôle allostérique important de l extrémité N-terminale dans la fonction de ce récepteur. Un double polymorphisme dans l extrémité N-terminale, associé à une vulnérabilité à l addiction, s est ainsi révélé être un gain de fonction du récepteur 5-HT2B. L identification d un rôle prépondérant du récepteur 5-HT2B dans les interactions sérotonine/dopamine ouvre de nouvelles perspectives dans l étude de la dépression, l impulsivité et l addictionThe role of the 5-HT2B receptor in the central nervous system is still unclear. By invalidating this receptor totally, specifically in serotonergic neurons or specifically in dopaminergic neurons, we have demonstrated an essential role of both presynaptic and postsynaptic 5-HT2B receptors. The presynaptic 5-HT2B receptors appear to be necessary to the biochemical and behavioral effects of amphetamine-derived molecules and antidepressants that act on the serotonin transporter (SERT). The study of the regulation of SERT by 5-HT2B receptors in the action of these molecules identified two potential phosphorylation sites involved in the mechanisms of serotonin uptake or efflux. This work also demonstrated that postsynaptic 5-HT2B receptors, located on dopaminergic neurons of the VTA, modulate the activity of these neurons in the mechanisms underlying impulsivity and addiction. Thus, two loss-of-function polymorphisms have been identified in humans and associated with impulsivity in the one hand and with addiction in the other. Finally, the structural study of 5-HT2B receptors revealed an important allosteric role of the N-terminus in the function of this receptor. A double polymorphism in the N-terminus, associated with a vulnerability to addiction, has been caracterised as a gain-of-function of the 5-HT2B receptor. The identification of a role of 5-HT2B receptor in serotonin / dopamine interactions opens new perspectives in the study of depression, impulsivity and addictionPARIS-BIUSJ-Biologie recherche (751052107) / SudocSudocFranceF

Rôle du récepteur 5-HT2B de la sérotonine dans l'hypertrophie cardiaque pathologique

L hypertrophie cardiaque pathologique se développe au cours d un mécanisme plus général dit remodelage myocardique. Ce remodelage est un phénomène complexe qui se met en place au décours de pathologies comme l infarctus du myocarde, une insuffisance valvulaire, une myocardite due à un agent infectieux ou l hypertension artérielle. Le rôle potentiel de la sérotonine et de ces récepteurs dans cette pathologie a été jusqu à présent très peu étudié. Cependant, plusieurs travaux ont démontré la capacité anti-hypertrophique en pathologie humaine d un antagoniste non-sélectif des récepteurs 5-HT2, la kétansérine, mais son utilisation fut arrêtée au début des années 90 car plusieurs cas d allongement du QT et de torsades de pointe furent rapportés. Plus tard, différents travaux ont attribué ces effets délétères à une action de la kétansérine sur des canaux ioniques voltage dépendants indépendamment de son effet antagoniste des récepteurs 5-HT2. Un rôle éventuel des récepteurs 5-HT2 dans l hypertrophie cardiaque a été à nouveau soupçonné par la génération dans notre laboratoire de souris transgéniques pour le récepteur 5-HT2B. En effet, nous avons montré que des souris invalidées pour le 5-HT2B (KO) présentent une cardiomyopathie dilatée sans hypertrophie compensatrice mais aussi que des souris surexprimants le récepteur 5-HT2B dans les cardiomyocytes développent une hypertrophie ventriculaire gauche. Nous nous sommes alors intéressés au rôle éventuel de ce récepteur 5-HT2B dans des modèles d hypertrophie cardiaque pathologique chez la souris. Dans un premier temps, nous avons montré que le blocage génétique (souris KO) ou pharmacologique du récepteur du 5-HT2B permet de prévenir la survenue d une hypertrophie induite par la perfusion d isoprénaline ou d angiotensine II chez la souris. Les fibroblastes cardiaques jouant un rôle important dans les réponses hypertrophiques, nous avons ensuite montré que le blocage du récepteur 5-HT2B permet de prévenir la libération de cytokines à capacité hypertrophique par le fibroblaste cardiaque adulte, inhibition qui pourrait expliquer l absence d hypertrophie cardiaque observée in vivo chez les souris KO ou en présence de l antagoniste 5-HT2B (SB206553). Par la suite, nous avons mis en évidence que l absence d hypertrophie cardiaque beta-adrénergique dépendante chez les souris KO globale est en réalité due à l absence du récepteur 5-HT2B, non pas sur les cardiomyocytes, mais sur les cellules non-cardiomyocytes puisque des souris exprimant le récepteur 5-HT2B uniquement dans les cardiomyocytes ne développent pas d hypertrophie suite à une perfusion d isoprénaline. Par ailleurs, nous avons défini qu il existe un mécanisme de transinhibition entre les récepteurs 5-HT2B et AT-1 de l angiotensine II dans les fibroblastes cardiaques. En effet, un antagoniste d un récepteur est capable de bloquer l activation de l autre et inversement. Enfin, nous avons montré que la libération de cytokines induite par la stimulation de ces deux récepteurs est dépendante de la transactivation du récepteur à l EGF, elle-même sous la dépendance du clivage du HB-EGF par des enzymes de type métalloprotéinases. Nous avons donc montré que le récepteur 5-HT2B joue un rôle majeur dans l hypertrophie cardiaque pathologique. Ce travail permet de suggérer l utilisation d antagoniste sélectif du récepteur 5-HT2B en thérapie humaine pour prévenir ou réduire l hypertrophie cardiaque pathologique. L hypertrophie cardiaque pathologique se développe au cours d un mécanisme plus général dit remodelage myocardique. Ce remodelage est un phénomène complexe qui se met en place au décours de pathologies comme l infarctus du myocarde, une insuffisance valvulaire, une myocardite due à un agent infectieux ou l hypertension artérielle. Le rôle potentiel de la sérotonine et de ces récepteurs dans cette pathologie a été jusqu à présent très peu étudié. Cependant, plusieurs travaux ont démontré la capacité anti-hypertrophique en pathologie humaine d un antagoniste non-sélectif des récepteurs 5-HT2, la kétansérine, mais son utilisation fut arrêtée au début des années 90 car plusieurs cas d allongement du QT et de torsades de pointe furent rapportés. Plus tard, différents travaux ont attribué ces effets délétères à une action de la kétansérine sur des canaux ioniques voltage dépendants indépendamment de son effet antagoniste des récepteurs 5-HT2. Un rôle éventuel des récepteurs 5-HT2 dans l hypertrophie cardiaque a été à nouveau soupçonné par la génération dans notre laboratoire de souris transgéniques pour le récepteur 5-HT2B. En effet, nous avons montré que des souris invalidées pour le 5-HT2B (KO) présentent une cardiomyopathie dilatée sans hypertrophie compensatrice mais aussi que des souris surexprimants le récepteur 5-HT2B dans les cardiomyocytes développent une hypertrophie ventriculaire gauche. Nous nous sommes alors intéressés au rôle éventuel de ce récepteur 5-HT2B dans des modèles d hypertrophie cardiaque pathologique chez la souris. Dans un premier temps, nous avons montré que le blocage génétique (souris KO) ou pharmacologique du récepteur du 5-HT2B permet de prévenir la survenue d une hypertrophie induite par la perfusion d isoprénaline ou d angiotensine II chez la souris. Les fibroblastes cardiaques jouant un rôle important dans les réponses hypertrophiques, nous avons ensuite montré que le blocage du récepteur 5-HT2B permet de prévenir la libération de cytokines à capacité hypertrophique par le fibroblaste cardiaque adulte, inhibition qui pourrait expliquer l absence d hypertrophie cardiaque observée in vivo chez les souris KO ou en présence de l antagoniste 5-HT2B (SB206553). Par la suite, nous avons mis en évidence que l absence d hypertrophie cardiaque beta-adrénergique dépendante chez les souris KO globale est en réalité due à l absence du récepteur 5-HT2B, non pas sur les cardiomyocytes, mais sur les cellules non-cardiomyocytes puisque des souris exprimant le récepteur 5-HT2B uniquement dans les cardiomyocytes ne développent pas d hypertrophie suite à une perfusion d isoprénaline. Par ailleurs, nous avons défini qu il existe un mécanisme de transinhibition entre les récepteurs 5-HT2B et AT-1 de l angiotensine II dans les fibroblastes cardiaques. En effet, un antagoniste d un récepteur est capable de bloquer l activation de l autre et inversement. Enfin, nous avons montré que la libération de cytokines induite par la stimulation de ces deux récepteurs est dépendante de la transactivation du récepteur à l EGF, elle-même sous la dépendance du clivage du HB-EGF par des enzymes de type métalloprotéinases. Nous avons donc montré que le récepteur 5-HT2B joue un rôle majeur dans l hypertrophie cardiaque pathologique. Ce travail permet de suggérer l utilisation d antagoniste sélectif du récepteur 5-HT2B en thérapie humaine pour prévenir ou réduire l hypertrophie cardiaque pathologique.PARIS-BIUSJ-Thèses (751052125) / SudocPARIS-BIUSJ-Physique recherche (751052113) / SudocSudocFranceF