Comparative study of plant SR genes regulation and function in Arabidopsis thaliana and Physcomitrella patens

Alternatives Spleißen (AS) ist ein hochregulierter Prozess, der mehrere mRNAVarianten aus einem einzigen Gen erzeugt und zur Transkriptom- und Proteom-Diversität und Feinabstimmung der Genexpression in höheren Eukaryoten wesentlich beiträgt. Einer der Hauptakteure in AS sind SR-Proteine, eine Familie von evolutionär konservierten Spleißfaktoren. Arabidopsis-Genom kodiert achtzehn SR-Proteine und ihre Regulierung und exakte Funktionen sind unklar. Um eine komplexe Regulierung von AS zu sezieren, ist es von großer Wichtigkeit, die Veränderungen in AS unter bestimmten Bedingungen präzise zu überwachen, aber solche Methoden sind in Pflanzen nicht gut etabliert. Die vorliegende Arbeit beschreibt die Entwicklung und Anwendung eines neuartigen hochauflösenden (HR) RT-PCR-Screens, um Veränderungen in mehreren bekannten AS-Ereignissen unter den gewünschten Bedingungen und genetischen Hintergründen zu messen. Das System erwies sich als reproduzierbar, präzise und auch in der Lage, neuartige AS-Transkripte zu erkennen. Während meiner Dissertation konzentrierte ich mich auf ein pflanzenspezifisches SRProtein At-RS31. HR-RT-PCR-Screen-Analyse der At-RS31-Überexpression (ÜE) Linie zeigte an, dass At-RS31 AS von Genen, die beteiligen sich am RNA-Metabolismus und Spleißen, Transkription und DNA-Reparatur, moduliert. Interessanterweise beeinflusste ÜE von At-RS31 das Spleißmuster des DNA-Reparaturgens UVH1/ATRAD1 und ähnlich wie bei uvh1 Mutanten waren At-RS31- ÜE -Pflanzen gegenüber der UV-C-Exposition überempfindlich. Erhöhte Levels von At-RS31 verschärfte Effekte von mehreren anderen abiotischen Belastungen und förderten eine frühe Seneszenz, was auf eine wichtige Rolle und eine enge Regulierung der At-RS31-Expression für das Überleben der Pflanzen in wechselnder Umgebung hindeutet. Die Kenntnis der in Arabidopsis gewonnenen Pflanzen-SR-Gene wurde durch das Studium des Moos Physcomitrella patens ergänzt. Obwohl evolutionärer entfernter Organismus, besitzt Physcomitrella SR-Gene mit hoch konservierter Struktur und AS zu Arabidopsis. Die Charakterisierung von AS in drei orthologen SR-Genen enthüllte ein extensives Spleißen im langen Intron von Pp-RS27 und mehrfache Spleißvarianten von zwei Genen der Pp-RS2Z-Subfamilie. Bemerkenswerterweise zeigte die Analyse von ASVarianten unter verschiedenen Wachstumsbedingungen, dass AS von Pp-RS27 Veränderungen in Reaktion auf UV-C und Licht gegenüber Dunkel zeigt, ähnlich die Beobachtungen in seinem Orthologe At-RS31, was auf einen hoch konservierten Mechanismus zur Regulierung von AS in Antwort auf externe Anregungen.Alternative splicing (AS) is a highly regulated process that generates multiple mRNA variants from a single gene and contributes greatly to the transcriptome and proteome diversity and fine tuning of gene expression in higher eukaryotes. One of the key players in AS are SR proteins, a family of evolutionary conserved splicing factors. Arabidopsis genome encodes eighteen SR proteins and their regulation and exact functions are unclear. To dissect complex regulation of AS it is of great importance to be able to precisely monitor changes in AS under specific conditions, however such methods are not well established in plants. Present thesis describes the development and application of a novel high resolution (HR) RT-PCR screen to measure changes in multiple known AS events at desired conditions and genetic backgrounds. The system was proven to be reproducible, accurate and also able to detect novel AS transcripts. During my dissertation I concentrated on a plant-specific SR protein At-RS31. HR RT-PCR screen analysis of At-RS31 overexpression (OE) line indicated that At-RS31 modulates AS of genes involved in RNA metabolism and splicing, transcription and DNA repair. Interestingly, OE of At-RS31 affected splicing pattern of the DNA repair gene UVH1/ATRAD1 and, similarly to uvh1-1 mutant, At-RS31 OE plants were hypersensitive to UV-C exposure. Increased levels of At-RS31 aggravated effects of several other abiotic stresses and promoted an early senescence, suggesting important role and tight regulation of At-RS31 expression for plant survival in changing environment. Knowledge of plant SR genes gained in Arabidopsis was complemented with the study of the moss Physcomitrella patens. Although evolutionary distant organism, it possesses SR genes with highly conserved structure and AS to Arabidopsis. Characterisation of AS in three orthologous SR genes uncovered extensive splicing in the long intron of Pp-RS27 and multiple splice variants of two genes of Physcomitrella RS2Z subfamily. Remarkably, analysis of AS patterns under different growth conditions revealed that AS of Pp-RS27 displays changes in response to UV-C and light vs dark similar to those observed in its orthologue At-RS31, indicating a highly conserved mechanism to regulate AS in response to external cues

Regulation of plant gene expression by alternative splicing

Abstract AS (alternative splicing) is a post-transcriptional process which regulates gene expression through increasing protein complexity and modulating mRNA transcript levels. Regulation of AS depends on interactions between trans-acting protein factors and cis-acting signals in the pre-mRNA (precursor mRNA) transcripts, termed 'combinatorial' control. Dynamic changes in AS patterns reflect changes in abundance, composition and activity of splicing factors in different cell types and in response to cellular or environmental cues. Whereas the SR protein family of splicing factors is well-studied in plants, relatively little is known about other factors influencing the regulation of AS or the consequences of AS on mRNA levels and protein function. To address fundamental questions on AS in plants, we are exploiting a high-resolution RT (reverse transcription)-PCR system to analyse multiple AS events simultaneously. In the present paper, we describe the current applications and development of the AS RT-PCR panel in investigating the roles of splicing factors, cap-binding proteins and nonsense-mediated decay proteins on AS, and examining the extent of AS in genes involved in the same developmental pathway or process