studio dell'espressione dello stem cell gene kit in precursori mesenchimali umani e murini

Le cellule staminali mesenchimali (MSCs) sono cellule clonogeniche multipotenti, capaci di differenziare in tipi cellulari di origine mesodermica come osteoblasti, condrociti, miociti, adipociti e cellule stromali. Principalmente presenti nel midollo osseo, sono state isolate anche da altri tessuti, quali muscolo scheletrico, tessuto adiposo, fluido amniotico, denti, cordone ombelicale. Le MSCs hanno suscitato grande interesse per la loro facile reperibilità e capacità di espandersi e differenziare in vitro. Inoltre, grazie alle loro proprietà biologiche, le MSCs rappresentano un potenziale valido strumento terapeutico per un ampio spettro di malattie, attraverso interventi di terapia genica e medicina rigenerativa. Tuttavia, il loro impiego ottimale richiede un’approfondita conoscenza dei meccanismi che ne regolano l’espansione e la differenziazione, ma a tutt’oggi molti aspetti della loro biologia sono ancora sconosciuti. Kit è un gene che codifica il recettore per lo Stem Cell Factor (SCF). È espresso da diversi tipi di cellule staminali e progenitori come cellule primordiali germinali, cellule staminali e precursori ematopoietici, melanoblasti, cellule staminali cardiache. Ancora controverso risulta il ruolo di Kit nelle MSCs e il mio lavoro di tesi è volto allo studio dell’espressione del recettore Kit in MSCs murine e umane, mantenute in coltura sia in uno stato indifferenziato sia indotte a differenziare in senso osteogenico e adipogenico. Colture primarie di MSCs murine e umane, prelevate da midollo osseo, sono state espanse e differenziate in vitro in presenza di agenti inducenti, quali β-Glicerofosfato, Acido Ascorbico e Dexametasone per la differenziazione osteogenica e Dexametasone, Isobutilmetilxantina, Indometacina e Insulina per la differenziazione adipogenica. Lo stadio differenziativo delle cellule è stato esaminato mediante PCR quantitativa (Real Time qPCR) attraverso l’analisi di espressione dei marcatori RUNX2 e ALP per l’osteogenesi e PPARγ, c/EBPα e aP2 per l’adipogenesi. Inoltre per valutare la percentuale di differenziazione è stata effettuata una colorazione istochimica Alizarin Red che mette in evidenza la formazione di matrice di fosfati di calcio tipica degli osteoblasti maturi e una colorazione Oil Red, che mette invece in evidenza la presenza delle gocce lipidiche all’interno degli adipociti. L’espressione di Kit è stata valutata mediante PCR (Real Time qPCR) in cellule indifferenziate e a tempi diversi della differenziazione osteogenica e adipogenica. I risultati mostrano che nelle MSCs indifferenziate murine e umane Kit risulta espresso a bassi livelli e durante la differenziazione osteogenica il gene viene completamente inattivato. Al contrario, nella differenziazione adipogenica, l’espressione di Kit aumenta negli stadi precoci della differenziazione e diminuisce in quelli più tardivi, suggerendo un probabile coinvolgimento del gene nell’attivazione del programma adipogenico. Per confermare questa ipotesi, l’espressione di Kit sarà analizzata in topi transgenici Kit/GFP, in cui il gene per la Green Fluorescent Protein (GFP) è posto sotto il controllo trascrizionale di regioni promotrici di Kit. Studi già condotti nel nostro laboratorio hanno dimostrato che l’espressione del transgene ricapitola in maniera fedele l’espressione del gene endogeno. Saranno quindi allestite colture di MSCs, prelevate da midollo osseo di topi transgenici Kit/GFP, indifferenziate e indotte a differenziare per valutare l’espressione del transgene attraverso l’analisi della fluorescenza emessa dalla GFP. In conclusione, i risultati finora ottenuti indicano una notevole analogia tra MSCs umane e murine. Inoltre forniscono la prima evidenza sperimentale per un possibile ruolo di Kit nell’adipogenesi. La comprensione dei meccanismi molecolari che regolano l’adipogenesi può avere importanti implicazioni per la diagnosi e la cura di patologie del tessuto adiposo

Key regulatory genes controlling cell fate decisions of Mesenchymal Stem Cells (MSCs)

Given their biological properties, Mesenchymal Stem Cells (MSCs) represent a potentially precious therapeutic tool for clinical application. However, their optimal use depends on our understanding of the molecular mechanisms governing their expansion and differentiation, still poorly understood. The kinase receptor Kit and the transcription factor Prep1 are pleiotropic regulators playing key roles in development and differentiation of multiple tissues, including hematopoiesis. The aim of my study is to investigate whether Kit and Prep1 contribute also to the control of MSCs, particularly in their commitment and differentiation towards the osteogenic and the adipogenic lineages, as MSCs and their progeny, in particular osteoblasts, are essential components of the hematopoietic stem cell niche. As a first step, the expression profiles at the transcriptional and protein level were analyzed in undifferentiated MSCs, and during in vitro osteogenic and adipogenic differentiation. Subsequently, to gain insights into Prep1 function in mesenchymal cells, the effects of its in vivo downregulation were investigated by using hypomorphic mice exhibiting low levels of Prep1 product. The expression studies have shown that Kit and Prep1 are both expressed in undifferentiated MSCs and that their activity is inversely correlated during the adipogenic process. Furthermore, analysis of MSCs derived from a Kit/GFP transgenic mouse line indicates that regulatory elements that drive correct kit expression in hematopoietic, germ and cardiac cells are not sufficient to control kit activity in MSCs. In addition, the functional studies demonstrate that down-regulation of Prep1, while favouring in vitro adipogenesis, strongly compromise the osteogenic process, leading cells to apoptosis after osteogenic induction. Taken together, results indicate that Kit and Prep1 are involved in the regulation of murine MSCs, and provide the first evidence pointing to Prep1 as a crucial player in mesenchymal cell fate decisions

Identification of a targetable KRAS-mutant epithelial population in non-small cell lung cancer

Lung cancer is the leading cause of cancer deaths. Tumor heterogeneity, which hampers development of targeted therapies, was herein deconvoluted via single cell RNA sequencingin aggressive human adenocarcinomas (carrying Kras-mutations) and comparable murine model. We identified a tumor-specific, mutant-KRAS-associated subpopulation which is conserved in both human and murine lung cancer. We previously reported a key role for the oncogene BMI-1 in adenocarcinomas. We therefore investigated the effects of in vivo PTC596 treatment, which affects BMI-1 activity, in our murine model. Post-treatment, MRI analysis showed decreased tumor size, while single cell transcriptomics concomitantly detected near complete ablation of the mutant-KRAS-associated subpopulation, signifying the presence of a pharmacologically targetable, tumor-associated subpopulation. Our findings therefore hold promise for the development of a targeted therapy for KRAS-mutant adenocarcinomas

EGFR signaling pathway as therapeutic target in human cancers

: Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) enacts major roles in the maintenance of epithelial tissues. However, when EGFR signaling is altered, it becomes the grand orchestrator of epithelial transformation, and hence one of the most world-wide studied tyrosine kinase receptors involved in neoplasia, in several tissues. In the last decades, EGFR-targeted therapies shaped the new era of precision-oncology. Despite major advances, the dream of converting solid tumors into a chronic disease is still unfulfilled, and long-term remission eludes us. Studies investigating the function of this protein in solid malignancies have revealed numerous ways how tumor cells dysregulate EGFR function. Starting from preclinical models (cell lines, organoids, murine models) and validating in clinical specimens, EGFR-related oncogenic pathways, mechanisms of resistance, and novel avenues to inhibit tumor growth and metastatic spread enriching the therapeutic portfolios, were identified. Focusing on non-small cell lung cancer (NSCLC), where EGFR mutations are major players in the adenocarcinoma subtype, we will go over the most relevant discoveries that led us to understand EGFR and beyond, and highlight how they revolutionized cancer treatment by expanding the therapeutic arsenal at our disposal