Estratégias para integração múltipla de cassetes de expressão no genoma de Komagataella phaffii

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2017.O aumento do número de cópias do gene heterólogo é uma das abordagens empregadas no melhoramento genético de Komagataella phaffii como sistema de expressão. O uso de marcas auxotróficas defectivas é uma estratégia para a obtenção de integrantes multicópia. Para garantir estabilidade mitótica, os cassetes de expressão são integrados no genoma por recombinação homóloga, portanto é necessário haver no vetor sequências genômicas que propiciem esses eventos de integração. O foco deste trabalho foi identificar sítios repetitivos no genoma de K. phaffii nunca antes testados como alvos de integração, em combinação com o uso da marca defectiva leu2-d, para aumentar a expressão heteróloga. Como alvos para integração múltipla foram avaliados os seguintes loci: rDNA 5S, região NTS do rDNA e regiões repetidas dos cromossomos 2 e 3. Um vetor contendo a marca leu2-d e o gene repórter EGFP (Enhanced Green FluorescentProtein) foi construído e foi usado como plataforma para clonar as diversas sequências repetidas. Todas as construções foram utilizadas para transformar K. phaffii M12 (leu2). A determinação do número de cópias integradas do cassete de expressão confirmou a obtenção de clones multicópia com todas as construções. Até 78 cópias do cassete contendo a sequência repetitiva do cromossomo 2 foram integradas. Todos os clones multicópiaapresentaram uma maior produção intracelular de GFP em comparação a um clone contendo uma única cópia do gene, chegando a se obter um aumento de 197 vezes com o clone contendo 78 cópias integradas do cassete. Para validar a estratégia apresentada neste estudo, foi testada a produção extracelular da proteína repórter α-amilase. Clones multicópia foram obtidos com as diferentes construções e até 43 cópias do cassete contendo a sequência repetitiva do cromossomo 2 foram integradas. A atividade amilolítica no sobrenadante confirmou a produção de amilase, que foi maior para os clones multicópia em comparação a um clone contendo uma cópia do gene, chegando a se obter um aumento de 4,6 vezes com o clone contendo 43 cópias integradas do cassete. A produção das duas proteínas avaliadas, demonstrou a possibilidade de obter clones multicópia que produzem uma maior quantidade da proteína recombinante. Contudo, foi observada perda de algumas cópias do cassete quando os clones transformantes foram crescidos em meio complexo, indicando baixa estabilidade genética na falta de pressão seletiva. Além disso, dependendo do local de integração, um alto número de cópias mostrou ter um efeito negativo no crescimento da levedura, porém, em nenhum dos casos a produção da proteína heteróloga diminuiu.Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPESIncreasing heterologous gene copy number is one of most commonly used strategies to improve Komagataellaphaffii as an expression system. The use of defective auxotrophic markers is an approach to obtain multicopy integrants. Expression cassettes must be integrated into the K. phaffii genome by homologous recombination to ensure mitotic stability. Therefore, it is necessary that the vector carries genomic sequences that will promote integration events. The aim of this work was to identify different sites for the integration of vectors carrying the auxotrophic defective marker leu2-d into the genome in order to increase the expression levels of heterologous genes in K. phaffii. The targets for integration studied were the following loci: 5S rDNA, NTS rDNA and repetitive regions of chromosomes 2 and 3. A vector carrying defective marker leu2-d and the EGFP(Enhanced Green Fluorescent Protein) reporter gene was constructed. This vector was used as platform to test repetitive sequences as targets for DNA integration. All constructions were used to transform K. phaffii M12 (leu2). Copy number determination confirmed the generation of multicopy clones with all the constructions. Up to 78 copies of the cassette containing the sequence of chromosome 2 were integrated. All multicopy clones showed more intracellular GFP production compared with a single-copy clone. A 197- fold increase of protein production was observed with the clone containing 78 copies of the cassette. To validate the strategy presented in this study, the expression of the reporter protein α- amylase was evaluated. Multicopy clones were obtained with the diverse constructions. Up to 43 copies of the cassette containing the sequence of chromosome 2 were integrated. Amylolytic activity in culture supernatants confirmed amylase production, which was higher for multicopy clones in comparison with a single-copy clone. A 4.6-fold increase of protein production was observed with the clone containing 43 copies of the cassette. Production of the two proteins tested showed the possibility to obtain multicopy clones which produce a larger quantity of the recombinant protein. Nevertheless, loss of some copies of the expression cassette was observed when transformants were grown in complex medium. This indicated low genetic stability in the absence of selective pressure. Moreover, depending of the integration locus higher copy number showed a negative effect in yeast growth. However, heterologous protein production was not decreased

Desenvolvimento de linhagem auxotrófica de Pichia pastoris para o metabolismo de leucina

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2014.A levedura Pichia pastoris tem sido amplamente utilizada na produção de proteínas recombinantes devido a características como fácil manipulação, rápido crescimento e capacidade de fazer modificações pós-traducionais mais similares às dos mamíferos. Apesar do vasto uso desta levedura como sistema de expressão, há poucas marcas de seleção disponíveis para sua manipulação genética. As marcas existentes podem ser auxotróficas (genes de vias biossintéticas como HIS4, ARG4, URA3, ADE1, dentre outros) ou dominantes (geralmente genes que conferem resistência a drogas). O limitado número de marcas seletivas atualmente disponíveis restringe a construção de cepas de P. pastoris contendo mais de uma modificação genética. Nesse contexto, o objetivo deste estudo foi interromper, pela primeira vez, o gene LEU2 no genoma de P. pastoris com o fim de gerar uma linhagem auxotrófica para o aminoácido leucina que pudesse ser utilizada como hospedeira para vetores contendo este gene como marca de seleção. A ruptura gênica foi obtida pela transformação da levedura com um cassete de expressão contendo os genes kanR (resistência a kanamicina/G418) ou Sh ble (resistência a zeocina) flanqueados por regiões 5´ e 3´ do gene LEU2 para promover a recombinação homóloga neste locus. Para construir esse cassete de deleção o gene clonado LEU2 teve um fragmento de aproximadamente 400 pb excisado após digestão com enzimas de restrição sendo substituído pelo cassete de expressão flanqueado por sequências loxP. Após transformação e seleção de mutantes auxotróficos, a marca dominante foi removida. Para tanto, a levedura foi transformada com um vetor contendo o gene que codifica para a proteína CreA, uma recombinase sítio-específica que catalisa a reação de recombinação entre duas sequências loxP. Finalmente, para testar esta nova linhagem, foi construído um vetor contendo eGFP como gene repórter e o gene LEU2 como marca de seleção. A transformação da linhagem auxotrófica leu2 com esse vetor confirmou a recuperação da prototrofia e a capacidade da levedura para produzir a proteína heteróloga intracelularmente. ______________________________________________________________________________ ABSTRACTThe yeast Pichia pastoris has been widely used for the production of recombinant proteins due to several characteristics such as easy genetic manipulation, fast growth and the ability to carry out post-translational modifications similarly to mammals. Despite the wide use of Pichia pastoris as expression system there are few selectable markers available for its genetic manipulation. The existing markers can be auxotrophic (genes of biosynthetic pathways, for example HIS4, ARG4, URA3, ADE1, among others) or dominant (mainly genes that confer drug resistance). The limited number of available selectable markers restricts the construction of strains with more than one recombinant modification. The aim of this study was to interrupt, for the first time, the LEU2 gene in the P. pastoris genome to generate an auxotrophic strain for the amino acid leucine which could be used as host strain for vectors carrying the LEU2 gene as selectable marker. The disruption was achieved transforming the yeast with an expression cassette that contained the kanR (kanamycin/G418 resistance) or Sh ble genes (zeocin resistance) flanked by regions from the LEU2 gene to promote homologous recombination at that locus in the P. pastoris genome. To construct that deletion cassette the cloned LEU2 gene had an excised fragment of approximately 400 bp after digestion with restriction enzymes. That fragment was substituted by the expression cassette flanked by loxP sequences. After transformation and selection of auxotrophic mutants the dominant marker was removed. To accomplish this, the yeast was transformed with a vector carrying the gene that codes for the CreA protein, a site-specific recombinase that catalyzes the recombination reaction between two loxP sequences. Finally, to test the new strain, it was constructed a vector containing eGFP as a reporter gene and the LEU2 gene as a selectable marker. Transformation of P. pastoris leu2 with that vector confirmed the recovery of the prototrophy and the ability of the yeast to produce the intracellular heterologous protein. ______________________________________________________________________________ RESUMENLa levadura Pichia pastoris ha sido ampliamente utilizada para la producción de proteínas recombinantes debido a características como fácil manipulación, rápido crecimiento y la capacidad de realizar modificaciones postraduccionales similares a las de los eucariotas. A pesar del gran uso de esta levadura como sistema de expresión hay pocas marcas de selección disponibles para su manipulación genética. Las marcas existentes pueden ser auxotróficas (genes de vías biosintéticas como HIS4, ARG4, URA3, ADE1, entre otros) o dominantes (principalmente genes que confieren resistencia a drogas). El limitado número de marcas de selección disponibles actualmente restringe la construcción de cepas de P. pastoris con más de una modificación recombinante. En este contexto, el objetivo de este estudio fue interrumpir, por primera vez, el gen LEU2 en el genoma de P. pastoris con el fin de generar una cepa auxotrófica para el aminoácido leucina que pudiera ser utilizada como hospedera para vectores que tengan el gen LEU2 como marca de selección. La ruptura se logró al transformar la levadura con un casete de expresión que contenía el gen kanR (resistencia a kanamicina/G418) o el gen Sh ble (resistencia a zeocina) flanqueado por regiones del gen LEU2 para promover recombinación homóloga en ese locus del genoma de P. pastoris. Para esto se clonó el gen LEU2 y se digirió con enzimas de restricción para retirar un fragmento de aproximadamente 400 pb el cual se reemplazó por el casete de expresión flanqueado por secuencias loxP. Después de la transformación y selección de mutantes auxotróficos se removió la marca dominante. Para esto se transformó la levadura con un vector que contenía el gen que codifica para la proteína CreA, una recombinasa sitio-específica que cataliza la reacción de recombinación entre dos secuencias loxP. Finalmente para evaluar la nueva cepa se construyó un vector que contenía el gen eGFP como reportero y el gen LEU2 como marca de selección. La transformación de P. pastoris leu2 con este vector confirmó la recuperación de la prototrofía y la capacidad de la levadura para producir la proteína heteróloga intracelularmente

Isolation and characterization of potential phytase-producing fungi from environmental samples of antioquia (colombia) / aislamiento y caracterización de hongos productores de fitasa a partir de muestras ambientales de antioquia (colombia)

Abstract. Phytases are enzymes used as feed additive that enhance the phosphorus and mineral uptake in monogastric animals and reduce the level of phosphate excretion in their manure. Due to their easy cultivation and high production of extracellular enzymes, filamentous fungi are one of best sources of phytase for use in the feed industry. Phytase has been found principally in the genera Aspergillus, Penicillium, Mucor and Rhizopus. In this work, we report the isolation and characterization of environmental fungi producers of phytase with potential use as feed additives. Samples were collected from soils, fruits and cereals in Antioquia (Colombia). A total of 26 fungal strains were isolated and identified using ITS sequencing and morphological analysis. Strains belonged to the following genera: Penicillium, Aspergillus, Fusarium, Mortierella, Pestalotiopsis, Phoma, Paecilomyces and Rigidoporus. Fifty percent of isolates exhibited halos in phytase screening agar indicating that acidic phytases are common enzymes secreted by environmental fungi. Ten isolates were also able to grow in liquid phytase screening medium revealing their potential use for enzyme production in submerged fermentations. Molecular detection of the PhyA gene from Aspergillus was achieved. Partial sequence of the phyA gene from one A. niger isolate was obtained and analyzed. / Resumen. Las fitasas son enzimas utilizadas como aditivo en productos de alimentación animal, con el fin de mejorar la asimilación de fósforo y minerales en animales monogástricos y disminuir la excreción de fósforo al ambiente. Los hongos filamentosos son una de las mejores fuentes de fitasas debido a su facilidad de cultivo y altos niveles de producción de enzimas extracelulares. Los principales productores de fitasas corresponden a miembros de los géneros Aspergillus, Penicillium, Mucor y Rhizopus. En este trabajo se reporta el aislamiento y caracterización de hongos ambientales productores de fitasas con aplicación potencial en la industria de alimentación animal. Se obtuvieron e identificaron un total de 26 aislamientos; caracterizados por secuenciación de la región ITS-ADNr y análisis morfológico. Los aislamientos pertenecieron a los siguientes géneros: Penicillium, Aspergillus, Fusarium, Mortierella, Pestalotiopsis, Phoma, Paecilomyces y Rigidoporus. Se observó la secreción de fitasas en 50% de los aislamientos sugiriendo la ubiquidad de esta enzima en hongos ambientales. Diez aislamientos crecieron eficientemente en medio líquido con fitato como única fuente de fósforo. Estos últimos cumplen con los requisitos para la producción de enzimas mediante fermentación sumergida. Se diseñaron cebadores para la detección molecular del gen PhyA en los aislamientos del género Aspergillus. Se obtuvo y analizó la secuencia parcial del gen PhyA de un aislamiento de A. nige

Multicopy plasmid integration in Komagataella phaffii mediated by a defective auxotrophic marker

Background: A commonly used approach to improve recombinant protein production is to increase the levels of expression by providing extra-copies of a heterologous gene. In Komagataella phaffii (Pichia pastoris) this is usually accomplished by transforming cells with an expression vector carrying a drug resistance marker following a screening for multicopy clones on plates with increasingly higher concentrations of an antibiotic. Alternatively, defective auxotrophic markers can be used for the same purpose. These markers are generally transcriptionally impaired genes lacking most of the promoter region. Among the defective markers commonly used in Saccharomyces cerevisiae is leu2-d, an allele of LEU2 which is involved in leucine metabolism. Cells transformed with this marker can recover prototrophy when they carry multiple copies of leu2-d in order to compensate the poor transcription from this defective allele. Results: A K. phaffii strain auxotrophic for leucine (M12) was constructed by disrupting endogenous LEU2. The resulting strain was successfully transformed with a vector carrying leu2-d and an EGFP (enhanced green fluorescent protein) reporter gene. Vector copy numbers were determined from selected clones which grew to different colony sizes on transformation plates. A direct correlation was observed between colony size, number of integrated vectors and EGFP production. By using this approach we were able to isolate genetically stable clones bearing as many as 20 integrated copies of the vector and with no significant effects on cell growth. Conclusions: In this work we have successfully developed a genetic system based on a defective auxotrophic which can be applied to improve heterologous protein production in K. phaffii. The system comprises a K. phaffii leu2 strain and an expression vector carrying the defective leu2-d marker which allowed the isolation of multicopy clones after a single transformation step. Because a linear correlation was observed between copy number and heterologous protein production, this system may provide a simple approach to improve recombinant protein productivity in K. phaffii

Aislamiento y Caracterización de Hongos Productores de Fitasa a partir de Muestras Ambientales de Antioquia (Colombia)

Abstract. Phytases are enzymes used as feed additive that enhance the phosphorus and mineral uptake in monogastric animals and reduce the level of phosphate excretion in their manure. Due to their easy cultivation and high production of extracellular enzymes, filamentous fungi are one of best sources of phytase for use in the feed industry. Phytase has been found principally in the genera Aspergillus, Penicillium, Mucor and Rhizopus. In this work, we report the isolation and characterization of environmental fungi producers of phytase with potential use as feed additives. Samples were collected from soils, fruits and cereals in Antioquia (Colombia). A total of 26 fungal strains were isolated and identified using ITS sequencing and morphological analysis. Strains belonged to the following genera: Penicillium, Aspergillus, Fusarium, Mortierella, Pestalotiopsis, Phoma, Paecilomyces and Rigidoporus. Fifty percent of isolates exhibited halos in phytase screening agar indicating that acidic phytases are common enzymes secreted by environmental fungi. Ten isolates were also able to grow in liquid phytase screening medium revealing their potential use for enzyme production in submerged fermentations. Molecular detection of the PhyA gene from Aspergillus was achieved. Partial sequence of the phyA gene from one A. niger isolate was obtained and analyzed. / Resumen. Las fitasas son enzimas utilizadas como aditivo en productos de alimentación animal, con el fin de mejorar la asimilación de fósforo y minerales en animales monogástricos y disminuir la excreción de fósforo al ambiente. Los hongos filamentosos son una de las mejores fuentes de fitasas debido a su facilidad de cultivo y altos niveles de producción de enzimas extracelulares. Los principales productores de fitasas corresponden a miembros de los géneros Aspergillus, Penicillium, Mucor y Rhizopus. En este trabajo se reporta el aislamiento y caracterización de hongos ambientales productores de fitasas con aplicación potencial en la industria de alimentación animal. Se obtuvieron e identificaron un total de 26 aislamientos; caracterizados por secuenciación de la región ITS-ADNr y análisis morfológico. Los aislamientos pertenecieron a los siguientes géneros: Penicillium, Aspergillus, Fusarium, Mortierella, Pestalotiopsis, Phoma, Paecilomyces y Rigidoporus. Se observó la secreción de fitasas en 50% de los aislamientos sugiriendo la ubiquidad de esta enzima en hongos ambientales. Diez aislamientos crecieron eficientemente en medio líquido con fitato como única fuente de fósforo. Estos últimos cumplen con los requisitos para la producción de enzimas mediante fermentación sumergida. Se diseñaron cebadores para la detección molecular del gen PhyA en los aislamientos del género Aspergillus. Se obtuvo y analizó la secuencia parcial del gen PhyA de un aislamiento de A. nige